🍎 Witamina C — HPLC

Chemia żywności PN-EN 14130

Przegląd

STATUS (stan na 03.11.2026). PN-EN 14130:2004 — wersja polska (opublikowana 17.12.2004), wprowadza EN 14130:2003 [IDT] i zastąpiła wersję angielską PN-EN 14130:2003. Norma jest WYCOFANA z dniem 21.11.2010, a karta PKN nie wskazuje normy zastępującej; CEN wycofał EN 14130:2003 z dniem 05.08.2010, także bez następczyni. Opis podaje treść normy wycofanej, z jej numeracją.

ZAKRES I ZASADA (rozdz. 1 i 3). Norma opisuje metodę HPLC oznaczania witaminy C w artykułach żywnościowych; witamina C to suma kwasu L(+)-askorbinowego i kwasu dehydro-L(+)-askorbinowego. Witaminę C ekstrahuje się z próbki roztworem kwasu metafosforowego, roztworem reduktora przeprowadza się kwas dehydroaskorbinowy w kwas L(+)-askorbinowy, a całkowitą zawartość kwasu L(+)-askorbinowego oznacza się metodą HPLC z detekcją UV przy 265 nm.

PRZYGOTOWANIE PRÓBKI I REDUKCJA (6.1–6.3). Roztwory wzorcowe i roztwory próbek przetwarza się możliwie szybko, utrzymuje poniżej 25 °C i nie analizuje po upływie 8 h. Próbkę homogenizuje się (materiał gruboziarnisty miele) i analizuje zaraz po homogenizacji. Odważkę, np. 3 g przy zawartości witaminy C około 50 mg/100 g, przenosi się do kolby 100 ml z 80 ml roztworu kwasu metafosforowego 20 g/l, uzupełnia tym roztworem do kreski i sączy; surowe warzywa i owoce (np. 2–10 g) rozdrabnia się bezpośrednio w zlewce z roztworem kwasu metafosforowego. Do 20 ml ekstraktu dodaje się 10 ml roztworu L-cysteiny 40 g/l, doprowadza pH do 7,0–7,2 roztworem fosforanu trisodowego i miesza dokładnie 5 min, następnie obniża pH do 2,5–2,8 roztworem kwasu metafosforowego 200 g/l, przenosi do kolby 50 ml, uzupełnia wodą i sączy przez filtr membranowy. Gdy próbka zawiera zagęstniki lub substancje żelujące, do 4 ml roztworu po redukcji dodaje się 1 ml metanolu i ponownie sączy. Stabilizatory roztworu kwasu askorbinowego (np. ditiotreitol) mogą wpływać na chromatografię i nie były stosowane w badaniu międzylaboratoryjnym.

WARUNKI CHROMATOGRAFICZNE (4.2.11, 5.4, 6.4). W badaniu międzylaboratoryjnym stosowano kolumnę z fazą odwróconą RP-18 z zablokowanymi grupami silanolowymi (5 µm, 250 mm × 4,0 mm), fazę ruchomą z 900 ml roztworu 13,6 g diwodorofosforanu potasu w wodzie i 100 ml roztworu 1,82 g bromku N-cetylo-N,N,N-trimetyloamoniowego w metanolu, przepływ 0,7 ml/min, nastrzyk 30 µl i detekcję przy 265 nm. Kryterium przydatności kolumny jest rozdzielenie do linii podstawowej kwasu L-askorbinowego i kwasu erytorbowego (izoaskorbinowego); tą samą procedurą można oznaczyć kwas erytorbowy, którego nie wlicza się do witaminy C. Norma podaje też inne odpowiednie warunki: fazę ruchomą z 10 % acetonitrylu i 90 % wody zawierającej 13,6 g/l diwodorofosforanu potasu i 2 g/l cetrimidu, kolumnę typu C8 (10 µm, 250 mm × 4,6 mm) i przepływ (1,0 ± 0,1) ml/min.

OBLICZENIE (6.5, rozdz. 7). Nastrzykuje się odpowiednie objętości roztworów wzorca i próbki (nie więcej niż 50 µl), integruje pola albo wysokości pików i porównuje z wzorcem albo z krzywą kalibracyjną, sprawdzając jej liniowość. Wynik podaje się jako ułamek masowy kwasu askorbinowego w mg/100 g próbki.

PRZEPISY. Według rozporządzenia (UE) nr 1169/2011 obowiązkową informację o wartości odżywczej można uzupełnić o witaminy wymienione w załączniku XIII część A pkt 1, obecne w znaczącej ilości (art. 30 ust. 2 lit. f); referencyjna wartość spożycia witaminy C dla osób dorosłych wynosi 80 mg.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Precyzji metody (rozdz. 8 i załącznik B) i przykładowego chromatogramu (załącznik A) — są poza dostępnym tekstem normy. Zakresu oznaczania, granicy wykrywalności i czasu analizy — dostępny tekst normy ich nie podaje.

Zasada metody

Witaminę C ekstrahuje się z próbki roztworem kwasu metafosforowego. Kwas dehydro-L(+)-askorbinowy redukuje się roztworem L-cysteiny w środowisku obojętnym do kwasu L(+)-askorbinowego, po czym roztwór ponownie zakwasza się kwasem metafosforowym. Redukcję prowadzi się przy pH 7,0–7,2 przez 5 min, a zakwasza do pH 2,5–2,8. Całkowitą zawartość kwasu L(+)-askorbinowego oznacza się metodą HPLC na kolumnie z fazą odwróconą z detekcją UV przy 265 nm i kalibracją zewnętrzną roztworami kwasu askorbinowego 5–50 µg/ml.

Zastosowania

• Oznaczanie witaminy C (suma kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego) w artykułach żywnościowych (rozdz. 1)
• Surowe warzywa i owoce — rozdrabnianie bezpośrednio w roztworze kwasu metafosforowego (6.2, 6.3.1)
• Produkty z zagęstnikami lub substancjami żelującymi — wytrącanie metanolem przed chromatografią (6.3.2)
• Oznaczanie kwasu erytorbowego (izoaskorbinowego) tą samą procedurą, bez wliczania go do witaminy C (6.4)
• Informacja o wartości odżywczej — witamina C jako składnik uzupełniający (rozporządzenie (UE) nr 1169/2011, art. 30 ust. 2)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN 14130:2004

Tytuł (PL)

Artykuły żywnościowe — Oznaczanie witaminy C metodą HPLC

Title (EN)

Foodstuffs — Determination of vitamin C by HPLC

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Zhomogenizuj próbkę, materiał gruboziarnisty zmiel i ponownie wymieszaj; analizuj zaraz po homogenizacji. Roztwory próbek i wzorców utrzymuj poniżej 25 °C i nie analizuj ich po 8 h (6.1, 6.2).

2. Ekstrakcja

   Odważ z dokładnością 1 mg odpowiednią ilość próbki (np. 3 g przy około 50 mg witaminy C w 100 g) do kolby 100 ml, dodaj 80 ml kwasu metafosforowego 20 g/l, wstrząśnij, uzupełnij tym roztworem do kreski, wstrząśnij i przesącz. Surowe warzywa i owoce (np. 2–10 g) rozdrobnij bezpośrednio w zlewce z kwasem metafosforowym i przenieś ilościowo do kolby 100 ml (6.3.1).

3. Redukcja

   Do 20 ml ekstraktu dodaj 10 ml roztworu L-cysteiny 40 g/l, mieszając doprowadź pH do 7,0–7,2 roztworem fosforanu trisodowego i mieszaj dokładnie 5 min. Obniż pH do 2,5–2,8 roztworem kwasu metafosforowego 200 g/l, przenieś ilościowo do kolby 50 ml, uzupełnij wodą i przesącz przez filtr membranowy (6.3.2).

4. Próbki z zagęstnikami

   Gdy próbka zawiera zagęstniki lub substancje żelujące, do 4 ml roztworu po redukcji dodaj 1 ml metanolu i przesącz przez filtr membranowy (6.3.2).

5. Chromatografia

   Zidentyfikuj kwas L-askorbinowy po czasie retencji wobec wzorca albo przez dodatek wzorca do roztworu próbki. Nastrzykuj odpowiednie objętości wzorca i próbki (nie więcej niż 50 µl); w badaniu międzylaboratoryjnym: kolumna RP-18, 0,7 ml/min, 30 µl, detekcja przy 265 nm (6.4, 6.5).

6. Obliczenie

   Zintegruj pola albo wysokości pików i porównaj z wzorcem albo z krzywą kalibracyjną (sprawdź liniowość); wynik podaj jako mg kwasu askorbinowego na 100 g próbki (6.5, rozdz. 7).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Norma ostrzega, że jej stosowanie może wiązać się z niebezpiecznymi materiałami, operacjami i sprzętem i że nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — zasady BHP i ograniczenia prawne ustala użytkownik (przedmowa)
• Metanol — w klasyfikacji zgłoszonej do ECHA: wysoce łatwopalny (H225), toksyczny po połknięciu, w kontakcie ze skórą i po wdychaniu (H301, H311, H331), powoduje uszkodzenie narządów (H370)

Najczęstsze pytania