🌿 Test hamowania świecenia Vibrio fischeri (bakterie liofilizowane)

Środowisko PN-EN ISO 11348-3

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 11348-3:2008 — wersja angielska (tytuł polski w katalogu PKN: „Jakość wody — Oznaczanie inhibicyjnego działania próbek wody na emisję światła przez Vibrio fischeri (badanie na bakteriach luminescencyjnych) — Część 3: Metoda z zastosowaniem liofilizowanych bakterii”), opublikowana 15.12.2008, wprowadza EN ISO 11348-3:2008 i ISO 11348-3:2007 [IDT]; zastąpiła PN-EN ISO 11348-3:2002 (wersję polską); zmiana PN-EN ISO 11348-3:2008/A1:2019-03 (wersja angielska, 7.03.2019) wprowadza EN ISO 11348-3:2008/A1:2018 i ISO 11348-3:2007/Amd 1:2018. Karta nie ma adnotacji o wycofaniu — norma aktualna. ISO 11348-3:2007 to wydanie drugie, które po nowelizacji technicznej zastąpiło ISO 11348-3:1998; w 2018 r. wydano zmianę ISO 11348-3:2007/Amd 1:2018 — zastępuje ona trzeci punkt kryteriów ważności (rozdz. 11): dla rozcieńczeń wyznaczających wartość LID odchylenie od ich średniej nie może przekraczać 3 punktów procentowych. Seria ISO 11348 ma trzy części: 1 — bakterie świeżo przygotowane, 2 — bakterie suszone w stanie ciekłym, 3 — bakterie liofilizowane. Nazwy handlowe zestawów nie są częścią normy — wymaga ona szczepu NRRL B-11177 z dostępnych w handlu odczynników liofilizowanych.

DLACZEGO TRZY CZĘŚCI (wprowadzenie). Prace normalizacyjne wykazały, że bakterie świeże, liofilizowane i suszone w stanie ciekłym mogą dawać różne wyniki, zwłaszcza przy metalach ciężkich: media ochronne użyte do konserwacji wpływają na biodostępność substancji toksycznych i na świecenie, a składu preparatów różnych dostawców użytkownik często nie zna. Dlatego część 3 opisuje procedurę z bakteriami liofilizowanymi, którą użytkownik może zinterpretować w każdym szczególe; wybór techniki należy do laboratorium.

ZAKRES (rozdz. 1). Hamowanie luminescencji emitowanej przez bakterię morską Vibrio fischeri (NRRL B-11177) — ścieki, wyciągi wodne i odcieki, wody słodkie (powierzchniowe i podziemne), wody morskie i słonawe, eluaty osadów (słodkowodnych, słonawych i morskich), woda porowa oraz pojedyncze substancje rozcieńczone w wodzie.

ZAKŁÓCENIA (rozdz. 4). Wynik mogą zaburzać substancje nierozpuszczalne, słabo rozpuszczalne, lotne albo reagujące z wodą do rozcieńczeń lub zawiesiną. Silna barwa albo mętność pochłania lub rozprasza światło — pomaga sedymentacja, wirowanie albo probówka korekcyjna z dwiema komorami (załącznik A). Duże zapotrzebowanie tlenu i łatwo rozkładalne składniki odżywcze obniżają świecenie niezależnie od zanieczyszczeń; pH poza zakresem 6,0–8,5 wpływa na luminescencję. Próbki słone często pobudzają świecenie, co może maskować hamowanie (załącznik D); zasolenie powyżej 30 g/l NaCl razem z wymaganym dodatkiem soli grozi efektami hiperosmotycznymi — łączne zasolenie nie powinno przekraczać osmolarności roztworu 35 g/l NaCl.

BAKTERIE, ROZTWORY I APARATURA (rozdz. 5–6). Zawiesiny przygotowuje się z dostępnych w handlu odczynników liofilizowanych przechowywanych w −18 °C do −20 °C; bakterie świecą zaraz po rekonstytucji. Rozcieńczalnikiem jest roztwór 20 g/l NaCl, a do bakterii liofilizowanych — roztwór 20 g NaCl, 2,035 g MgCl₂·6H₂O i 0,30 g KCl w 1 l. Substancje odniesienia, w stężeniach około dwukrotnie większych od oczekiwanej EC50: siarczan cynku siedmiowodny 19,34 mg/l, 3,5-dichlorofenol 6,8 mg/l i dichromian potasu 105,8 mg/l; każdą dostarczoną partię bakterii bada się wszystkimi trzema, a co najmniej jedną — równolegle z każdą rekonstytuowaną fiolką. Termoblok utrzymuje próbki w (15 ± 1) °C, z odchyleniem w jednym badaniu najwyżej ± 0,3 °C; luminometr ma celę pomiarową w (15 ± 1) °C, a zawiesinę podstawową przechowuje się w (4 ± 3) °C.

PRÓBKI (rozdz. 7). Pojemniki według ISO 5667-16 napełnia się do pełna; bada się jak najszybciej — do 48 h w 2–5 °C w ciemności, do dwóch miesięcy w −18 °C lub niżej, bez chemicznych środków konserwujących. Tlen w próbce ma przekraczać 3 mg/l (inaczej napowietrzanie albo mieszanie); pH 6,0–8,5 zwykle nie wymaga korekty, w razie potrzeby koryguje się je do 7,0 ± 0,2 albo do granic 6,0 i 8,5. Do próbki dodaje się 20 g NaCl na litr (przy próbkach zasolonych — tyle, by osmolarność odpowiadała 20 g/l NaCl; przy 20–50 g/l równoważnika NaCl soli się nie dodaje). Próbki silnie mętne odstawia się na 1 h, odwirowuje (np. 10 min przy 5 000 g) albo sączy.

PRZEBIEG (rozdz. 8). Fiolkę liofilizatu (zawartość na najwyżej 100 pomiarów) wyjmuje się z zamrażarki tuż przed rekonstytucją: 1 ml wody destylowanej schłodzonej do (4 ± 3) °C wlewa się do fiolki od razu, w całości, bez pipety. Zawiesina podstawowa ma około 10⁸ komórek w mililitrze i służy do badań, dopóki spełnia kryteria ważności. Po co najmniej 10 min przygotowuje się zawiesiny testowe: w wariancie A dodaje się po 10 µl zawiesiny podstawowej do 500 µl roztworu do bakterii liofilizowanych w probówkach w (15 ± 1) °C, w wariancie B miesza się w kolbie stożkowej 1 objętość zawiesiny podstawowej z 50 objętościami tego roztworu w (4 ± 3) °C i rozpipetowuje po 500 µl do probówek w (15 ± 1) °C — w obu wariantach w tych samych odstępach czasu (5–20 s) co późniejsze pomiary. Ponieważ łączy się równe objętości próbki i zawiesiny, najwyższe stężenie próbki w badaniu wynosi z reguły 50 %; badanie próbek prawie nierozcieńczonych (80 %) wymaga dodatkowej kontroli. Luminescencję mierzy się po 15 min albo 30 min (opcjonalnie po 5 min), z poprawką fkt na zmianę natężenia w próbkach kontrolnych w czasie ekspozycji (rozdz. 3).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Szczegółowy przebieg pomiaru, wzory obliczeń (rozdz. 9–10), pozostałe kryteria ważności (rozdz. 11) i precyzja (rozdz. 12, załącznik C) są poza dostępnym tekstem wydania z 2007 r.

Zasada metody

Określone objętości próbki albo jej rozcieńczeń łączy się w probówkach z zawiesiną bakterii Vibrio fischeri i mierzy luminometrem ich świecenie w (15 ± 1) °C — po 15 min albo 30 min kontaktu, opcjonalnie także po 5 min.

Hamowanie świecenia liczy się względem próbek kontrolnych z roztworem chlorku sodu, z poprawką fkt na zmianę ich świecenia w czasie ekspozycji; z szeregu rozcieńczeń wyznacza się najmniejsze nieefektywne rozcieńczenie (LID) albo wartości EC20 i EC50 (rozdz. 3).

Zastosowania

• Ścieki (rozdz. 1)
• Wyciągi wodne i odcieki (rozdz. 1)
• Wody słodkie powierzchniowe i podziemne; wody morskie i słonawe — z uwzględnieniem pobudzenia świecenia przez sól (rozdz. 1, załącznik D)
• Eluaty osadów słodkowodnych, słonawych i morskich; woda porowa (rozdz. 1)
• Pojedyncze substancje rozcieńczone w wodzie (rozdz. 1)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 11348-3:2008 + A1:2019-03

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie inhibicyjnego działania próbek wody na emisję światła przez Vibrio fischeri (badanie na bakteriach luminescencyjnych) — Część 3: Metoda z zastosowaniem liofilizowanych bakterii

Title (EN)

Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria

Procedura krok po kroku

1. Próbka

   Pojemniki według ISO 5667-16, napełnione do pełna; badanie jak najszybciej — do 48 h w 2–5 °C w ciemności, do dwóch miesięcy w −18 °C lub niżej; bez środków konserwujących (7.1).

2. Przygotowanie próbki

   Tlen powyżej 3 mg/l, w razie potrzeby napowietrzyć; pH 6,0–8,5 zwykle bez korekty, w razie potrzeby do 7,0 ± 0,2; dodać 20 g NaCl na litr; próbki mętne — odstawić na 1 h, odwirować (np. 10 min, 5 000 g) albo przesączyć (7.2).

3. Szereg i kontrole

   Szereg rozcieńczeń (załącznik B), próbki odniesienia i kontrole z roztworem NaCl w probówkach w (15 ± 1) °C; nowa partia bakterii — wszystkie trzy substancje odniesienia, każda fiolka — co najmniej jedna (8.1).

4. Zawiesina podstawowa

   1 ml wody destylowanej schłodzonej do (4 ± 3) °C wlać do fiolki z liofilizatem od razu, w całości, bez pipety; około 10⁸ komórek w mililitrze; przechowywanie w (4 ± 3) °C (8.2).

5. Zawiesiny testowe

   Po co najmniej 10 min — w wariancie A po 10 µl zawiesiny podstawowej do 500 µl roztworu do bakterii liofilizowanych w (15 ± 1) °C; w wariancie B 1 objętość zawiesiny podstawowej na 50 objętości roztworu w (4 ± 3) °C w kolbie stożkowej, potem po 500 µl do probówek; w tych samych odstępach czasu (5–20 s) co późniejsze pomiary (8.3).

6. Pomiar i wynik

   Świecenie po 15 min albo 30 min (opcjonalnie po 5 min), z poprawką fkt z próbek kontrolnych; wynik jako LID albo EC20 i EC50 (rozdz. 3).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Norma zastrzega, że badanie wymaga znajomości zwykłej praktyki laboratoryjnej i odpowiednio przeszkolonego personelu, a zasady BHP ustala użytkownik (ostrzeżenie normy)
• Dichromian potasu jest substancją rakotwórczą, toksyczną przy wdychaniu; norma dopuszcza gotowe preparaty o określonym stężeniu (5.6, uwaga; ISO 6341, 6.4)

Najczęstsze pytania