🧬 STEC/VTEC — E. coli werotoksyczne

Mikrobiologia ISO/TS 13136

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). ISO/TS 13136:2012 — specyfikacja techniczna, wydanie pierwsze, opublikowana 07.11.2012, aktualna; przygotował ją CEN we współpracy z ISO/TC 34/SC 9 (porozumienie wiedeńskie), w Europie jako CEN ISO/TS 13136:2012. Katalog PKN nie ma jej przyjęcia (wyszukiwarka 02.11.2026: brak wyników dla „TS 13136”, a to samo zapytanie dla „TS 22964” znajduje PKN-ISO/TS 22964:2008) — oznaczenia „PN-EN ISO/TS 13136” nie ma, a tytuł polski jest tłumaczeniem roboczym. Rewizję prowadzi się jako projekty ISO/DIS 13136-1 i ISO/DIS 13136-2 (w CEN m.in. prEN ISO 13136-1:2024).

ZAKRES (rozdz. 1). Identyfikacja STEC przez wykrywanie głównych genów wirulencji STEC (stx i eae) i genów związanych z serogrupami O157, O111, O26, O103 i O145; technologią odniesienia jest PCR w czasie rzeczywistym. Gdy wykryto jeden lub oba geny stx, zawsze podejmuje się próbę izolacji szczepu; izolację szczepów z serogrup objętych zakresem ułatwia namnażanie swoiste dla serogrupy, np. separacja immunomagnetyczna (IMS). Specyfikacja dotyczy produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt, próbek środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością oraz z produkcji pierwotnej.

ZNACZENIE (wprowadzenie, uwaga „Ważne”). STEC to chorobotwórcze E. coli, które mogą wywołać biegunkę i cięższe choroby — krwotoczne zapalenie okrężnicy i zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS); z najcięższymi postaciami, zwłaszcza HUS, wiążą się serogrupy O157, O26, O111, O103 i O145. Każdy STEC uważa się za chorobotwórczy dla człowieka — ryzyko zależy od rodzaju żywności (gotowa do spożycia albo poddawana obróbce, np. pasteryzacji lub gotowaniu) i stanu zdrowia osoby. Nowe układy cech wirulencji mogą dać nowe patotypy, jak enteroagregacyjne E. coli O104 wytwarzające toksynę Shiga, które w maju i czerwcu 2011 r. wywołały ogniska HUS w Niemczech i we Francji; takie szczepy mieszczą się w zakresie metody, bo mają geny stx. Nazewnictwo: stx = vtx, Stx = Vtx (werotoksyna), STEC = VTEC. Według rozdziału 4a podręcznika BAM (FDA) dawkę zakaźną O157:H7 szacuje się na 10–100 komórek (dla innych serotypów EHEC brak danych), a zakażenia przenosi głównie żywność albo woda — wiązano je z niedogotowaną wołowiną mieloną, surowym mlekiem, kanapkami na zimno, wodą, niepasteryzowanym sokiem jabłkowym, kiełkami i warzywami.

DEFINICJE (p. 3.1–3.3). STEC — szczepy E. coli z genami kodującymi Stx; STEC wywołujące uszkodzenie typu „attaching and effacing” — z genami Stx i genem intyminy eae (połączenie często związane z najcięższymi postaciami choroby); STEC z serogrup wysoce chorobotwórczych — z genami Stx i eae, należące do serogrup O157, O111, O26, O103 albo O145.

NAMNAŻANIE I GENY DOCELOWE (p. 4.2–4.6, 5.1). Porcję badaną namnaża się w nieselektywnym podłożu płynnym (rozcieńczenie 1 : 10): w mTSB z 16 mg/l nowobiocyny (mTSB+N) — próbki z dużą florą towarzyszącą, w zbuforowanej wodzie peptonowej (BPW) — próbki z komórkami uszkodzonymi (np. mrożonki) i mniejszą florą, a w mTSB z 12 mg/l akryflawiny (mTSB+A) — mleko i przetwory mleczne. Nowobiocyna w zwykłym stężeniu 20 mg/l (jak w ISO 16654) hamuje około jednej trzeciej szczepów spoza O157 i zwiększa ryzyko wyników fałszywie ujemnych. Geny docelowe: stx1 i stx2 (warianty stx2a, stx2b i stx2c), eae oraz rfbE (O157), wbdI (O111), wzx (O26), ihp1 (O145) i wzx (O103). Szczep izoluje się po namnażaniu swoistym dla serogrupy (np. IMS) na agarze z tryptonem, żółcią i glukuronidem (TBX) albo na podłożu swoistym, gdy jest dostępne.

PRZEPISY. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026), kryterium 1.29: kiełki — STEC O157, O26, O111, O103, O145 oraz O104:H4 nie wykryto w 25 g, n = 5, c = 0, metoda CEN/ISO TS 13136 z uwzględnieniem dostosowań laboratorium referencyjnego Unii Europejskiej ds. E. coli w odniesieniu do wykrywania STEC O104:H4 (przypis 22); kryterium nie dotyczy kiełków poddanych skutecznej obróbce eliminującej salmonelle i STEC (przypis 23). Próbki kiełków pobiera się na etapie największego prawdopodobieństwa wykrycia STEC i salmonelli, nie wcześniej niż 48 h po rozpoczęciu kiełkowania (zał. I rozdz. 3).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Dostępny tekst specyfikacji kończy się na p. 9.1.3 (zawiesina wyjściowa). Warunków inkubacji namnażania (p. 9.2), ekstrakcji kwasów nukleinowych (p. 9.3), programu PCR i kryteriów odczytu (p. 9.4), starterów i sond (zał. C i E), kontroli amplifikacji (zał. D) i przebiegu izolacji (p. 9.5, zał. F) nie podajemy.

Zasada metody

Metoda obejmuje kolejno: namnażanie mikrobiologiczne, ekstrakcję kwasów nukleinowych, wykrycie genów wirulencji, wykrycie genów związanych z serogrupami i izolację z próbek dodatnich (p. 4.1, zał. A). Liczbę komórek STEC zwiększa się inkubacją porcji badanej w nieselektywnym podłożu płynnym (mTSB+N, BPW albo mTSB+A), kwas nukleinowy ekstrahuje się według przyjętego systemu wykrywania i wykrywa w nim geny stx, eae i geny serogrup metodą PCR w czasie rzeczywistym (p. 4.2–4.5). Gdy podejrzewa się obecność STEC, podejmuje się izolację; przy wykryciu serogrupy z zakresu — po namnażaniu swoistym, np. IMS, i posiewie na agar TBX albo podłoże swoiste (p. 4.6).

Zastosowania

• Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1)
• Próbki środowiskowe z produkcji i obrotu żywnością oraz z produkcji pierwotnej (rozdz. 1)
• Mleko i przetwory mleczne — namnażanie w mTSB z akryflawiną (p. 4.2)
• Kiełki — kryterium bezpieczeństwa żywności dla STEC O157, O26, O111, O103, O145 i O104:H4 (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 1.29)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

ISO/TS 13136:2012 (CEN ISO/TS 13136:2012)

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145

Title (EN)

Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

Procedura krok po kroku

1. Zawiesina wyjściowa

   Użyć tyle podłoża namnażającego, by otrzymać rozcieńczenie 10⁻¹ porcji badanej (p. 9.1.1).

2. Próbki z dużą florą towarzyszącą

   Porcję stałą (x g) przenieść do worka homogenizatora perystaltycznego (najlepiej z filtrem) z 9x ml mTSB z nowobiocyną albo akryflawiną i homogenizować; porcję płynną (x ml) przenieść jałową pipetą do 9x ml tego podłoża (p. 9.1.2).

3. Próbki z komórkami uszkodzonymi

   Mrożonki rozmrozić w temperaturze pokojowej, porcję (x g albo x ml) przenieść do 9x ml BPW i postępować jak wyżej (p. 9.1.3).

4. Namnażanie

   Inkubować w cieplarce (37 ± 1) °C (p. 6.2); czas i warunki — p. 9.2, poza dostępnym tekstem.

   🌡 Temperatura: 37 ± 1 °C

5. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

   Według wymagań przyjętego systemu wykrywania (p. 4.3, 9.3).

6. Wykrywanie genów

   PCR w czasie rzeczywistym: geny wirulencji stx i eae, potem geny serogrup O157, O111, O26, O103 i O145 (p. 4.1, 4.4, 9.4).

7. Izolacja

   Gdy wykryto jeden lub oba geny stx, podjąć izolację szczepu; przy wykryciu serogrupy z zakresu — namnażanie swoiste (np. IMS) i posiew na agar TBX albo podłoże swoiste (rozdz. 1, p. 4.6, zał. F).

8. Wynik

   Kategorie wyniku według definicji: STEC (geny stx), STEC z genem eae, STEC z serogrup O157, O111, O26, O103 albo O145 z genami stx i eae (p. 3.1–3.3, rozdz. 10).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Każdy STEC uważa się za chorobotwórczy dla człowieka i mogący wywołać ciężką chorobę — zależnie od rodzaju żywności i stanu zdrowia osoby (uwaga „Ważne” w specyfikacji)
• Praktykę laboratoryjną i wymagania dla PCR specyfikacja odsyła do ISO 7218, ISO 22174 i ISO 20838 (rozdz. 2)

Najczęstsze pytania