🧫 Pseudomonas aeruginosa w wodzie
Krótko: o co chodzi
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa metodą filtracji membranowej na podłożu CN z cetrimidem i kwasem nalidyksowym, przeznaczone dla wody butelkowanej i innych wód z małą liczbą bakterii towarzyszących, takich jak woda basenowa i woda do spożycia. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 16266:2009; Sączek: jałowy, nominalna wielkość porów 0,45 µm; sprawdzanie według ISO 7704 (p. 4.1, 6.4). Procedura obejmuje 7 kroków; stosuje się je m.in. do: Woda butelkowana — zwykle próbka 250 ml (rozdz. 1, wprowadzenie), Woda basenowa i woda przeznaczona do spożycia — zwykle 100 ml (rozdz. 1, wprowadzenie), Naturalne wody mineralne i wody źródlane — wykluczenie obecności w 250 ml przy ujęciu i w opakowaniu (Dz.U. 2011 nr 85 poz. 466, § 4 i § 10).
W skrócie
- Norma: PN-EN ISO 16266:2009
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 7
- Sączek: jałowy, nominalna wielkość porów 0,45 µm; sprawdzanie według ISO 7704 (p. 4.1, 6.4)
- Podłoże: podłoże podstawowe dla Pseudomonas z suplementem CN: cetrimid 0,2 g/l, kwas nalidyksowy 0,015 g/l (p. 5.1.1)
- Inkubacja: (36 ± 2) °C (p. 6.2); (44 ± 4) h — według karty podłoża wytwarzanego zgodnie z normą (rozdz. 8 poza dostępnym tekstem)
Przegląd
STATUS (stan na 29.10.2026). PN-EN ISO 16266:2009 — wersja polska, opublikowana 09.11.2009, wprowadza EN ISO 16266:2008 [IDT] i ISO 16266:2006 [IDT]; zastąpiła angielską wersję PN-EN ISO 16266:2008. Norma aktualna — bez adnotacji o wycofaniu. ISO 16266:2006 jest odpowiednikiem EN 12780:2002 (przedmowa normy) i ma w katalogu status normy obowiązującej.
ZAKRES (rozdz. 1). Izolacja i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa w próbkach wody butelkowanej metodą filtracji membranowej. Metodę można stosować także do innych wód z małą liczbą bakterii towarzyszących, takich jak woda basenowa i woda przeznaczona do spożycia. Część 2 tej serii (PN-EN ISO 16266-2) opisuje inną metodę — najbardziej prawdopodobnej liczby.
ZNACZENIE (wprowadzenie). P. aeruginosa jest patogenem oportunistycznym człowieka, zdolnym do wzrostu w wodzie przy bardzo małym stężeniu składników odżywczych. W wodzie butelkowanej bada się zwykle 250 ml próbki; inne wody, w tym basenowe i przeznaczone do spożycia, bada się czasem ze względów zdrowia publicznego — wtedy zwykle 100 ml.
DEFINICJA (rozdz. 3). P. aeruginosa to mikroorganizmy rosnące na podłożach selektywnych z cetrimidem i wytwarzające piocyjaninę albo rosnące na tych podłożach, oksydazododatnie, fluoryzujące w promieniowaniu UV o długości fali (360 ± 20) nm i zdolne do wytwarzania amoniaku z acetamidu.
PRZEPISY. Naturalne wody mineralne i wody źródlane: badanie przy ujęciu ma wykluczyć obecność P. aeruginosa w 250 ml, a woda wprowadzana do obrotu w opakowaniu musi spełniać ten wymóg (Dz.U. 2011 nr 85 poz. 466, § 4 ust. 3 i 5, § 10). Pływalnie: 0 w 100 ml w wodzie wprowadzanej do niecki i w wodzie w niecce (Dz.U. 2022 poz. 1230, zał. nr 1). Woda do spożycia w zbiornikach środków transportu lądowego i wodnego: 0 w 100 ml; w środkach transportu powietrznego: do 10 w 100 ml w punkcie czerpalnym najdalej od zbiornika, po zakończonym locie — wynik powyżej 10 wymaga działań naprawczych (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. A tab. 2–3); metodą referencyjną jest PN-EN ISO 16266 (zał. nr 4 cz. A).
CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się na rozdz. 7 (pobieranie próbek). Przebieg oznaczenia (rozdz. 8), wyrażanie wyników (rozdz. 9), dane walidacji (rozdz. 11), zakłócenia (rozdz. 12), zapewnienie jakości (rozdz. 13) i podłoża zamienne (zał. B) są poza nim. Czas inkubacji (44 ± 4) h podajemy za kartą podłoża wytwarzanego zgodnie z normą — dostępny tekst podaje temperaturę cieplarki (36 ± 2) °C.
Zasada metody
Odmierzoną objętość próbki albo jej rozcieńczenie przesącza się przez sączek membranowy 0,45 µm, który układa się na podłożu selektywnym i inkubuje w warunkach właściwych dla tego podłoża (p. 4.1). Liczbę domniemanych P. aeruginosa ustala się, licząc kolonie charakterystyczne na sączku: kolonie wytwarzające piocyjaninę uznaje się za potwierdzone, a inne kolonie fluoryzujące albo czerwonobrązowe wymagają potwierdzenia (p. 4.2). Kolonie do potwierdzenia przesiewa się z sączka na agar odżywczy; po inkubacji kultury początkowo niefluoryzujące bada się na oksydazę, a oksydazododatnie — na wytwarzanie fluoresceiny i amoniaku z acetamidu; kultury początkowo fluoryzujące bada się tylko na wytwarzanie amoniaku z acetamidu (p. 4.3).
Zastosowania
- Woda butelkowana — zwykle próbka 250 ml (rozdz. 1, wprowadzenie)
- Woda basenowa i woda przeznaczona do spożycia — zwykle 100 ml (rozdz. 1, wprowadzenie)
- Naturalne wody mineralne i wody źródlane — wykluczenie obecności w 250 ml przy ujęciu i w opakowaniu (Dz.U. 2011 nr 85 poz. 466, § 4 i § 10)
- Pływalnie — 0 w 100 ml w wodzie wprowadzanej do niecki i w niecce (Dz.U. 2022 poz. 1230, zał. nr 1)
- Woda do spożycia w zbiornikach środków transportu — metoda referencyjna (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. A i zał. nr 4 cz. A)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Sączek | jałowy, nominalna wielkość porów 0,45 µm; sprawdzanie według ISO 7704 (p. 4.1, 6.4) |
| Podłoże | podłoże podstawowe dla Pseudomonas z suplementem CN: cetrimid 0,2 g/l, kwas nalidyksowy 0,015 g/l (p. 5.1.1) |
| Inkubacja | (36 ± 2) °C (p. 6.2); (44 ± 4) h — według karty podłoża wytwarzanego zgodnie z normą (rozdz. 8 poza dostępnym tekstem) |
| Lampa UV | promieniowanie o długości fali (360 ± 20) nm (p. 3.1, 6.3) |
| Objętość próbki | woda butelkowana — zwykle 250 ml; woda basenowa i do spożycia — zwykle 100 ml (wprowadzenie) |
| Potwierdzenie | piocyjanina — potwierdzone; kolonie fluoryzujące albo czerwonobrązowe — oksydaza, fluoresceina na podłożu Kinga B, amoniak z acetamidu (p. 4.2–4.3) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 16266:2009
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration
Procedura krok po kroku
-
Pobranie próbki
Pobieranie, utrwalanie i postępowanie z próbkami — według ISO 5667-1, ISO 5667-2, ISO 5667-3 i ISO 19458 (rozdz. 7).
-
Filtracja
Odmierzoną objętość próbki albo jej rozcieńczenie przesączyć przez sączek 0,45 µm — wodę butelkowaną zwykle w ilości 250 ml, inne wody zwykle 100 ml (p. 4.1, wprowadzenie).
-
Inkubacja na agarze CN
Sączek ułożyć na podłożu CN i inkubować w (36 ± 2) °C (p. 4.1, 6.2) — przez (44 ± 4) h według karty podłoża wytwarzanego zgodnie z normą.
-
Liczenie kolonii
Policzyć kolonie charakterystyczne, oglądając sączek także pod lampą UV (360 ± 20) nm: kolonie wytwarzające piocyjaninę są potwierdzonymi P. aeruginosa; inne kolonie fluoryzujące albo czerwonobrązowe wymagają potwierdzenia (p. 4.2, 6.3).
-
Subkultura
Kolonie do potwierdzenia przesiać z sączka na płytki z agarem odżywczym (podłoża zamienne — zał. B) (p. 4.3).
-
Potwierdzenie
Kultury początkowo niefluoryzujące zbadać na oksydazę; oksydazododatnie — na wytwarzanie fluoresceiny (podłoże Kinga B) i amoniaku z acetamidu (bulion z acetamidem, wykrywanie odczynnikiem Nesslera). Kultury początkowo fluoryzujące zbadać tylko na wytwarzanie amoniaku z acetamidu (p. 3.1, 4.3, 5.2).
-
Wynik
Liczba kolonii potwierdzonych w przesączonej objętości; zasady obliczania — rozdz. 9 i ISO 8199, poza dostępnym tekstem normy.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Szkło laboratoryjne | sterylizowane przed użyciem — w suszarce w (170 ± 5) °C przez 1 h albo w autoklawie w (121 ± 3) °C przez 15 min (p. 6.1) | — |
| Cieplarka | utrzymująca (36 ± 2) °C (p. 6.2) | — |
| Lampa UV | emitująca promieniowanie o długości fali (360 ± 20) nm (p. 6.3) | — |
| Sączki membranowe | jałowe, nominalna wielkość porów 0,45 µm; regularnie sprawdzane według ISO 7704 (p. 6.4) | — |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Podłoże podstawowe dla Pseudomonas (agar CN) | — | pepton żelatynowy 16,0 g, hydrolizat kazeiny 10,0 g, siarczan potasu bezwodny 10,0 g, chlorek magnezu bezwodny 1,4 g, glicerol 10 ml, agar 11,0–18,0 g, woda 1000 ml; zawiesić, dodać glicerol, zagotować, sterylizować w (121 ± 3) °C przez 15 min, ostudzić do 45–50 °C, dodać suplement CN uwodniony w 2 ml jałowej wody, rozlać na warstwę co najmniej 5 mm; pH 7,1 ± 0,2 w 25 °C; płytki w ciemności w (5 ± 3) °C do miesiąca; podłoża nie trzymać upłynnionego dłużej niż 4 h ani ponownie nie upłynniać (p. 5.1.1) |
| Suplement CN — cetrimid (bromek heksadecylotrimetyloamoniowy) | 57-09-0 | 0,2 g na 1000 ml podłoża (p. 5.1.1.1) |
| Suplement CN — kwas nalidyksowy | 389-08-2 | 0,015 g na 1000 ml podłoża (p. 5.1.1.1) |
| Podłoże Kinga B | — | pepton 20,0 g, glicerol 10 ml, wodorofosforan dipotasu 1,5 g, siarczan magnezu heptahydrat 1,5 g, agar 15,0 g, woda 1000 ml; pH 7,2 ± 0,2 w 25 °C; po 5 ml do probówek, sterylizacja (121 ± 3) °C, 15 min, skosy; w ciemności w (5 ± 3) °C do 3 miesięcy (p. 5.2.1) |
| Bulion z acetamidem | 60-35-5 | roztwór A: KH₂PO₄ 1,0 g, MgSO₄ bezwodny 0,2 g, acetamid 2,0 g, NaCl 0,2 g w 900 ml wody bez amoniaku, pH 7,0 ± 0,5; roztwór B: molibdenian sodu dihydrat 0,5 g i siarczan żelaza(II) heptahydrat 0,05 g w 100 ml wody; 1 ml roztworu B do 900 ml świeżego roztworu A, dopełnić do 1 l, po 5 ml do probówek, sterylizacja (121 ± 3) °C, 15 min; w ciemności w (5 ± 3) °C do 3 miesięcy (p. 5.2.2) |
| Agar odżywczy | — | pepton 5,0 g, ekstrakt mięsny 1,0 g, ekstrakt drożdżowy 2,0 g, NaCl 5,0 g, agar 15,0 g, woda 1000 ml; sterylizacja (121 ± 3) °C, 15 min; pH 7,4 ± 0,2 w 25 °C; płytki osuszyć przed użyciem, przechowywać w ciemności w (5 ± 3) °C do miesiąca (p. 5.2.3) |
| Odczynnik oksydazowy | 637-01-4 | 0,1 g dichlorowodorku tetrametylo-p-fenylenodiaminy w 10 ml wody, rozpuścić tuż przed użyciem i chronić przed światłem — odczynnik nietrwały, przygotowywać w małych ilościach; dopuszczalne handlowe testy oksydazy (p. 5.2.4) |
| Odczynnik Nesslera | 7487-94-7 | 10 g chlorku rtęci(II) i 7 g jodku potasu (CAS 7681-11-0) rozpuścić w małej ilości wody i dodawać powoli, mieszając, do ostudzonego roztworu 16 g NaOH w 50 ml wody; rozcieńczyć do 100 ml; przechowywać w szkle borokrzemianowym z gumowym korkiem, bez dostępu światła słonecznego, najwyżej rok (p. 5.2.5) |
| Woda | — | klasy 3 według ISO 3696 albo o równoważnej czystości, bez substancji hamujących wzrost; odczynniki o czystości analitycznej albo podłoża handlowe przygotowane według instrukcji producenta (rozdz. 5) |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Acetamid jest rakotwórczy i drażniący — zachować środki ostrożności przy ważeniu, przygotowaniu i usuwaniu podłoża (p. 5.2.2.1)
- Chlorek rtęci(II) w odczynniku Nesslera jest toksyczny — nie dopuścić do połknięcia (p. 5.2.5)
- Osoby korzystające z normy powinny znać zwykłą praktykę laboratoryjną, a badania muszą wykonywać odpowiednio przeszkoleni pracownicy; ustalenie zasad BHP należy do użytkownika (ostrzeżenie normy)
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 16266:2009 — „Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Metoda filtracji membranowej”. Tytuł angielski: „Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration”.
Na czym polega ta metoda?
Odmierzoną objętość próbki albo jej rozcieńczenie przesącza się przez sączek membranowy 0,45 µm, który układa się na podłożu selektywnym i inkubuje w warunkach właściwych dla tego podłoża (p. 4.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Sączek: jałowy, nominalna wielkość porów 0,45 µm; sprawdzanie według ISO 7704 (p. 4.1, 6.4); Podłoże: podłoże podstawowe dla Pseudomonas z suplementem CN: cetrimid 0,2 g/l, kwas nalidyksowy 0,015 g/l (p. 5.1.1); Inkubacja: (36 ± 2) °C (p. 6.2); (44 ± 4) h — według karty podłoża wytwarzanego zgodnie z normą (rozdz. 8 poza dostępnym tekstem); Lampa UV: promieniowanie o długości fali (360 ± 20) nm (p. 3.1, 6.3).
Ile trwa wykonanie badania?
Procedura obejmuje 7 kroków. Norma nie podaje czasu trwania dla wszystkich etapów — decyduje procedura laboratorium.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Szkło laboratoryjne, Cieplarka, Lampa UV, Sączki membranowe.
Gdzie stosuje się to badanie?
Woda butelkowana — zwykle próbka 250 ml (rozdz. 1, wprowadzenie); Woda basenowa i woda przeznaczona do spożycia — zwykle 100 ml (rozdz. 1, wprowadzenie); Naturalne wody mineralne i wody źródlane — wykluczenie obecności w 250 ml przy ujęciu i w opakowaniu (Dz.U. 2011 nr 85 poz. 466, § 4 i § 10); Pływalnie — 0 w 100 ml w wodzie wprowadzanej do niecki i w niecce (Dz.U. 2022 poz. 1230, zał. nr 1); Woda do spożycia w zbiornikach środków transportu — metoda referencyjna (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. A i zał. nr 4 cz. A).
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Acetamid jest rakotwórczy i drażniący — zachować środki ostrożności przy ważeniu, przygotowaniu i usuwaniu podłoża (p. 5.2.2.1); Chlorek rtęci(II) w odczynniku Nesslera jest toksyczny — nie dopuścić do połknięcia (p. 5.2.5); Osoby korzystające z normy powinny znać zwykłą praktykę laboratoryjną, a badania muszą wykonywać odpowiednio przeszkoleni pracownicy; ustalenie zasad BHP należy do użytkownika (ostrzeżenie normy).
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 16266.