🍄 Aflatoksyny B1, B2, G1 i G2 w orzechach, figach i papryce — HPLC z oczyszczaniem immunopowinowactwem

Chemia żywności PN-EN 14123

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN 14123:2008 — wersja polska, opublikowana 12.09.2008, wprowadza EN 14123:2007 [IDT]; zastąpiła angielską wersję PN-EN 14123:2008, która zastąpiła PN-EN 14123:2004; karta PKN bez adnotacji o wycofaniu (odczyt 02.11.2026). EN 14123:2007 zastąpiła EN 14123:2003 — jedyną zmianą było dołączenie danych walidacyjnych dla orzechów laskowych. Opis opiera się na podglądzie EN 14123:2007 (iTeh, SIST EN 14123:2008: rozdz. 1–5 i 6.1–6.3) oraz na badaniu międzylaboratoryjnym, na którym oparto metodę (J. Stroka i in., J. AOAC Int. 2000, 83: 320–340).

ZAKRES (rozdz. 1). Oznaczanie aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 w orzechach laskowych, figach, pistacjach, orzechach ziemnych i papryce w proszku. Granica oznaczalności wynosi 0,8 ng/g dla każdej aflatoksyny albo mniej (wartość z badań wewnątrzlaboratoryjnych i międzylaboratoryjnych), zależnie od aparatury. Ochratoksyny A ani aflatoksyny M1 norma nie obejmuje; aflatoksynę B1 w żywności na bazie zbóż dla niemowląt i małych dzieci oznacza się według osobnej normy PN-EN 15851:2012 (wprowadza EN 15851:2010).

ZASADA (rozdz. 3). Porcję ekstrahuje się mieszaniną metanolu i wody albo tą mieszaniną z dodatkiem heksanu (lub cykloheksanu). Ekstrakt sączy się, rozcieńcza buforowanym fosforanem roztworem soli (PBS) i nanosi na kolumnę powinowactwa immunologicznego (IAC) z przeciwciałami swoistymi dla aflatoksyn B1, B2, G1 i G2; aflatoksyny wymywa się z kolumny metanolem. Oznacza się je metodą RP-HPLC z derywatyzacją za kolumną przez bromowanie i detekcją fluorescencyjną; brom wytwarza się elektrochemicznie albo dostarcza bromkiem perbromkiem pirydyniowym (PBPB). Badanie międzylaboratoryjne z 2000 r. opisuje ten sam przebieg: ekstrakcję metanolem z wodą (8 + 2) — dla orzechów ziemnych i pistacji z heksanem lub cykloheksanem — rozcieńczenie PBS, przemycie kolumny wodą, elucję metanolem i bromowanie za kolumną w celi elektrochemicznej (z bromkiem w fazie ruchomej) albo PBPB.

ODCZYNNIKI (rozdz. 4). Woda klasy 3 według EN ISO 3696, do HPLC klasy 1. PBS o pH 7,4: 0,20 g chlorku potasu, 0,20 g diwodorofosforanu potasu, 1,16 g wodorofosforanu disodu (albo 2,92 g dodekahydratu) i 8,00 g chlorku sodu w 0,9 l wody, pH 7,4, uzupełnienie do 1 l (dopuszczalne tabletki o równoważnych właściwościach). Mieszanina ekstrakcyjna: 8 części objętościowych metanolu i 2 części wody; n-heksan albo cykloheksan; chlorek sodu. Kolumna IAC: pojemność co najmniej 100 ng aflatoksyny B1 i odzysk co najmniej 80 % dla B1, B2 i G1 oraz co najmniej 60 % dla G2 (wodny roztwór wzorcowy z 10 % metanolu, po 5 ng każdej toksyny); nanoszony roztwór może zawierać najwyżej 12 % metanolu. Faza ruchoma A (z PBPB): woda, acetonitryl i metanol 6 : 2 : 3; faza ruchoma B (z bromem elektrochemicznym): ta sama mieszanina z 120 mg bromku potasu i 350 µl kwasu azotowego 4 mol/l na litr. Odczynnik pokolumnowy: 50 mg PBPB w 1 l wody (do czterech dni w ciemności, w temperaturze pokojowej). Roztwory podstawowe aflatoksyn po 10 µg/ml w toluenie z acetonitrylem (98 + 2); stężenie ustala się z widma absorpcji od 330 nm do 370 nm: ρ = Amax · M · 100 / (ε · b), gdzie M i ε: B1 312 g/mol i 1930 m²/mol, B2 314 i 2040, G1 328 i 1660, G2 330 i 1790. Pięć roztworów kalibracyjnych zawiera od 0,400 ng/ml do 3,600 ng/ml aflatoksyny B1 i G1 oraz od 0,080 ng/ml do 0,720 ng/ml B2 i G2 (tablica 2).

APARATURA (rozdz. 5). Szkło stykające się z wodnymi roztworami aflatoksyn myje się kwasem (np. kwasem siarkowym 2 mol/l przez kilka godzin) — szkło niemyte kwasem powoduje straty aflatoksyn. Młynek laboratoryjny albo przeciwwybuchowy blender szybkoobrotowy (do past i ekstrakcji orzechów i fig), wytrząsarka (do papryki), sączki karbowane, filtr z mikrowłókna szklanego (1,6 µm lub mniej), zbiornik 75 ml i pompka do IAC, opcjonalnie przystawka próżniowa. HPLC: pompa do przepływu 1,0 ml/min; dozowanie całkowitym wypełnieniem pętli, zalecana pętla 100 µl (przy innej pętli granica wykrywalności najwyżej 0,2 ng/g i oznaczalności najwyżej 0,5 ng/g dla każdej aflatoksyny); kolumna RP, np. C18 albo ODS-2, 25 cm × 4,6 mm, 5 µm, rozdzielająca piki aflatoksyn do linii podstawowej (nakładanie poniżej 10 %); układ derywatyzacji z PBPB (pompa bezpulsacyjna, trójnik o zerowej objętości martwej, przewód reakcyjny PTFE co najmniej 45 cm × 0,5 mm) — tylko z fazą A — albo układ elektrochemicznego wytwarzania bromu — tylko z fazą B; detektor fluorescencyjny z filtrem wzbudzenia 360 nm i odcinającym emisji 420 nm, a w detektorach z monochromatorem zalecane 365 nm (wzbudzenie), 435 nm (emisja) i szerokość pasma 18 nm. Ponadto filtry jednorazowe 0,45 µm (sprawdzone pod kątem strat aflatoksyn), waga analityczna 0,1 mg i laboratoryjna 0,01 g.

PRZEBIEG (rozdz. 6.1–6.3). Odpowiednią ilość (np. 10 kg) pistacji, orzechów ziemnych, orzechów laskowych i fig homogenizuje się na pastę; wielkość próbek i ich pobieranie określają przepisy UE. Kolumnę IAC doprowadza się do temperatury pokojowej i kondycjonuje 10 ml PBS przepuszczanego z szybkością od 2 ml/min do 3 ml/min, zostawiając nad złożem około 0,5 ml. Pasty ekstrahuje się blenderem szybkoobrotowym (tłuste pasty muszą utworzyć emulsję, a pasta z fig — rozpaść się w rozpuszczalniku); paprykę zmieloną do cząstek najwyżej 500 µm można ekstrahować wytrząsaniem. Orzechy laskowe: około 50 g, 4 g chlorku sodu i 100 ml wody — 1 min miksowania; potem 150 ml metanolu — 2 min; 5 ml przesączu (odpowiada 1 g próbki) z 15 ml PBS na kolumnę. Figi: około 50 g, 5 g chlorku sodu i 300 ml mieszaniny ekstrakcyjnej — 3 min; 10 ml przesączu z 60 ml PBS. Orzechy ziemne i pistacje: około 50 g, 5 g chlorku sodu, 200 ml mieszaniny ekstrakcyjnej i 100 ml n-heksanu albo cykloheksanu — 3 min; po sączeniu dolna faza, 10 ml z 60 ml PBS (pistacje przy dużym zmętnieniu: 20 ml przesączu z 140 ml PBS, przesączenie, 70 ml na kolumnę). Papryka: około 50 g, 5 g chlorku sodu i 300 ml mieszaniny ekstrakcyjnej — energiczne wytrząsanie ręką od 15 s do 30 s, potem 30 min na wytrząsarce; 10 ml przesączu z 60 ml PBS. Porcje odważa się z dokładnością 0,1 g; większe porcje są dopuszczalne przy zachowaniu stosunku próbki do rozpuszczalnika.

PRZEPISY. Najwyższe dopuszczalne poziomy aflatoksyn ustala rozporządzenie (UE) 2023/915 (zał. I pkt 1.1), które uchyliło rozporządzenie (WE) nr 1881/2006; dla matryc tej normy (aflatoksyna B1 / suma B1, B2, G1 i G2, µg/kg): suszone figi 6,0 / 10,0; orzeszki ziemne do sortowania 8,0 / 15,0, dla konsumenta 2,0 / 4,0; pistacje (z migdałami i pestkami moreli) do sortowania 12,0 / 15,0, dla konsumenta 8,0 / 10,0; orzechy laskowe (z brazylijskimi) do sortowania 8,0 / 15,0, dla konsumenta 5,0 / 10,0; papryka i inne przyprawy z rodzaju Capsicum 5,0 / 10,0. Dla sumy aflatoksyn poziomy odnoszą się do dolnej granicy stężeń — wartości poniżej granicy oznaczalności przyjmuje się za zero.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Oczyszczania na kolumnie IAC (objętości przemywania i elucji), warunków chromatografii i derywatyzacji, obliczeń i danych precyzji (6.4–7, zał. B) — tych części normy nie ma w podglądzie. W badaniu międzylaboratoryjnym z 2000 r. (16 laboratoriów; próbki z dodatkiem 2,4 ng/g i 9,6 ng/g sumy aflatoksyn) odzysk sumy aflatoksyn wynosił od 71 % do 92 %, a aflatoksyny B1 — od 82 % do 109 %.

Zasada metody

Porcję próbki (około 50 g) ekstrahuje się mieszaniną metanolu i wody (8 + 2) z chlorkiem sodu — orzechy ziemne i pistacje z dodatkiem n-heksanu albo cykloheksanu, orzechy laskowe najpierw wodą, potem metanolem. Przesącz rozcieńcza się buforem PBS (najwyżej 12 % metanolu) i przepuszcza przez kolumnę powinowactwa immunologicznego, na której przeciwciała wiążą aflatoksyny B1, B2, G1 i G2; aflatoksyny wymywa się metanolem.

Eluat rozdziela się metodą HPLC w układzie faz odwróconych. Za kolumną aflatoksyny bromuje się — bromem wytwarzanym elektrochemicznie (bromek potasu i kwas azotowy w fazie ruchomej) albo roztworem bromku perbromku pirydyniowego — i wykrywa detektorem fluorescencyjnym (wzbudzenie 360–365 nm, emisja 420–435 nm). Wynik podaje się dla aflatoksyny B1 i dla sumy czterech aflatoksyn.

Zastosowania

• Orzechy laskowe, orzechy ziemne, pistacje, figi i papryka w proszku — aflatoksyna B1 i suma aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 (rozdz. 1)
• Kontrola najwyższych dopuszczalnych poziomów aflatoksyn z rozporządzenia (UE) 2023/915 (zał. I pkt 1.1.3–1.1.11, 1.1.14) w tych produktach
• Żywność na bazie zbóż dla niemowląt i małych dzieci (aflatoksyna B1) — osobna norma PN-EN 15851:2012; ochratoksyna A i aflatoksyna M1 — poza zakresem tej normy

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN 14123:2008

Tytuł (PL)

Artykuły żywnościowe — Oznaczanie aflatoksyny B1 oraz sumy aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 w orzechach laskowych, orzechach ziemnych, pistacjach, figach i papryce w proszku — Metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z uzyskiwaniem pochodnej po rozdziale na kolumnie i oczyszczaniu na kolumnie powinowactwa immunologicznego

Title (EN)

Foodstuffs — Determination of aflatoxin B1 and the sum of aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in hazelnuts, peanuts, pistachios, figs, and paprika powder — High performance liquid chromatographic method with post-column derivatisation and immunoaffinity column cleanup

Procedura krok po kroku

1. Homogenizacja próbki

   Odpowiednią ilość (np. 10 kg) orzechów i fig przerabia się na pastę blenderem szybkoobrotowym; paprykę miele się do cząstek najwyżej 500 µm (6.1, 6.3.1).

2. Kondycjonowanie kolumny IAC

   Kolumna w temperaturze pokojowej; 10 ml PBS z szybkością od 2 ml/min do 3 ml/min, około 0,5 ml PBS zostaje nad złożem (6.2).

3. Ekstrakcja

   Około 50 g z chlorkiem sodu: orzechy laskowe — 100 ml wody (1 min) i 150 ml metanolu (2 min); figi — 300 ml metanolu z wodą 8 + 2 (3 min); orzechy ziemne i pistacje — 200 ml mieszaniny i 100 ml heksanu lub cykloheksanu (3 min); papryka — 300 ml mieszaniny, 30 min na wytrząsarce (6.3.2–6.3.6).

4. Rozcieńczenie przesączu

   Orzechy laskowe: 5 ml przesączu z 15 ml PBS; pozostałe: 10 ml przesączu z 60 ml PBS; pistacje przy wytrąceniu osadu: 20 ml przesączu z 140 ml PBS, przesączenie, 70 ml na kolumnę (6.3).

5. Oczyszczanie, HPLC i wynik

   Rozcieńczony ekstrakt na kolumnę IAC, przemycie wodą, elucja metanolem; RP-HPLC z bromowaniem za kolumną i detekcją fluorescencyjną; kalibracja pięcioma roztworami (tablica 2); szczegóły w 6.4–7 normy, poza podglądem (rozdz. 3; badanie z 2000 r.).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Odpady laboratoryjne z aflatoksynami odkaża się według procedur opracowanych przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (IARC) (ostrzeżenie 1 w 4.19)
• Aflatoksyny rozkładają się na świetle: laboratorium chroni się przed światłem dziennym (folia pochłaniająca UV, przytłumione światło), a roztwory przechowuje w ciemności, w folii aluminiowej albo szkle oranżowym, w temperaturze zalecanej przez producenta, np. −18 °C (ostrzeżenie 2 w 4.19)
• Metanol, acetonitryl, heksan i cykloheksan są łatwopalne, a metanol toksyczny — postępować według kart charakterystyki; norma nie omawia wszystkich zagrożeń, środki bezpieczeństwa ustala użytkownik (ostrzeżenie w przedmowie)

Najczęstsze pytania