🔴 Legionella w wodzie

Mikrobiologia PN-EN ISO 11731

Przegląd

STATUS (stan na 29.10.2026). PN-EN ISO 11731:2017-08 — wersja polska, opublikowana 25.09.2019, wprowadza EN ISO 11731:2017 [IDT] i ISO 11731:2017 [IDT]; zastąpiła PN-EN ISO 11731-2:2008 i PN-ISO 11731:2002; ma poprawkę krajową PN-EN ISO 11731:2017-08/Ap1:2019-12 (zatwierdzoną 05.12.2019), która prostuje błędy polskiej wersji — m.in. tytuły p. 8.4.2 i 8.4.3 (w obu chodzi o próbki z MAŁĄ ilością drobnoustrojów towarzyszących), ostatnie zdanie p. 4.1, opisy przygotowania podłoży w zał. B oraz tekst i przykłady macierzy decyzyjnej w zał. J. Norma aktualna — bez adnotacji o wycofaniu. ISO 11731:2017 (wydanie drugie) zastąpiło po rewizji technicznej ISO 11731:1998 i ISO 11731-2:2004 (przedmowa normy).

ZAKRES (rozdz. 1). Hodowlane metody izolacji bakterii z rodzaju Legionella i szacowania ich liczby w próbkach wody wszystkich rodzajów — wody do picia, wód przemysłowych, ścieków i wód naturalnych — oraz w matrycach związanych z wodą, takich jak biofilm i osady. Nie wszystkie gatunki Legionella dają się hodować, dlatego metody nie wykrywają wszystkich gatunków.

ZNACZENIE (wprowadzenie). Bakterie Legionella występują powszechnie w naturalnych i sztucznych środowiskach wodnych, w glebie i kompoście i mogą wywoływać legionelozę; potrafią namnażać się wewnątrz pierwotniaków (Acanthamoeba castellanii, Hartmannella, Naegleria). Opisano co najmniej 61 gatunków, w 26 z nich — szczepy zakażające ludzi; Legionella pneumophila ma co najmniej 15 serogrup. Monitoring służy wskazaniu źródeł ryzyka legionelozy, takich jak chłodnie wyparne (wieże chłodnicze), instalacje ciepłej i zimnej wody w budynkach z urządzeniami — wannami z hydromasażem, unitami stomatologicznymi i klimatyzatorami — a także walidacji środków kontroli i sprawdzaniu, czy nadal działają.

DOBÓR SPOSOBU BADANIA (rozdz. 8, zał. J). Laboratorium dobiera sposób do rodzaju próbki według macierzy decyzyjnej z zał. J. W większości przypadków potrzebne jest zagęszczenie filtracją membranową; posiew bezpośredni próbki niezagęszczonej można wykonać, gdy spodziewana liczba przekracza 10⁴ jtk/l, a próbki silnie zanieczyszczone rozcieńcza się i posiewa bezpośrednio przed obróbką i po niej. Norma rozróżnia próbki: z dużą liczbą Legionella i małą liczbą mikroorganizmów przeszkadzających, z małą liczbą obu, z dużą i z bardzo dużą liczbą mikroorganizmów przeszkadzających — i do każdego przypadku podaje zestaw obróbek i podłoży (p. 8.4.2–8.4.5). Przykłady z macierzy (zał. J w brzmieniu poprawki Ap1): woda z małą ilością drobnoustrojów towarzyszących, np. woda pitna — p. 8.4.2 albo 8.4.3, zależnie od spodziewanej liczby Legionella; woda z dużą ilością, np. z wież chłodniczych, woda przemysłowa, z komór zraszania i z unitów stomatologicznych — p. 8.4.4; woda z bardzo dużą ilością, np. ścieki i woda powierzchniowa — p. 8.4.5 (obróbka ciepłem i kwasem). Przykładowa granica wykrywalności: 500 ml przesączonej próbki, wymycie w 5 ml wody i posiew 0,1 ml — 100 jtk/l; jeżeli na płytkach z porcją nieobrobioną i ogrzaną wystąpi przerost, a na płytce po obróbce kwasowej nie wykryto Legionella, granica wzrasta dziesięciokrotnie (zał. J, tablica J.1, w brzmieniu poprawki Ap1).

PRZEPISY. Woda do spożycia w wewnętrznych systemach wodociągowych: wartość parametryczna bakterii z rodzaju Legionella poniżej 1000 jtk/l, a w budynkach podmiotów leczniczych ze stacjonarnymi świadczeniami, w których przebywają pacjenci o obniżonej odporności — poniżej 50 jtk/l (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. E). Ocena poziomu zanieczyszczenia ciepłej wody użytkowej (w nawiasach — dla takich budynków podmiotów leczniczych): niski poniżej 1000 jtk/l (poniżej 50), średni od 1000 do poniżej 10 000 jtk/l (od 50 do poniżej 100), wysoki od 10 000 do poniżej 100 000 jtk/l (od 100 do poniżej 1000), bardzo wysoki od 100 000 jtk/l (od 1000); od poziomu średniego — przegląd systemu i środków kontroli, a przy powtórzeniu — czyszczenie i dezynfekcja; przy poziomie wysokim — także wyłączenie pryszniców i urządzeń wytwarzających aerozol wodny; przy bardzo wysokim — to samo w trybie natychmiastowym (zał. nr 5). PN-EN ISO 11731 jest metodą referencyjną; do monitoringu weryfikacyjnego opartego na ryzyku i uzupełnienia metod hodowlanych można stosować także ISO/TS 12869, szybkie metody hodowlane, metody nieoparte na hodowli i metody molekularne, w szczególności qPCR (zał. nr 4 cz. A). Pływalnie: Legionella sp. 0 w 100 ml w wodzie wprowadzanej do niecki, w nieckach z urządzeniami wytwarzającymi aerozol wodno-powietrzny i w nieckach do nauki pływania niemowląt i małych dzieci, a w wodzie w niecce — gdy jej temperatura wynosi co najmniej 30 °C; w wodzie z natrysków (instalacje wody ciepłej) — poniżej 100 w 100 ml (Dz.U. 2022 poz. 1230, zał. nr 1).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się w p. 8.4.7 (przeglądanie płytek). Przebieg potwierdzania (p. 8.5), wyrażanie wyników (rozdz. 9), sprawozdanie (rozdz. 10), zapewnienie jakości (rozdz. 11), składy podłoży, rozcieńczalników i roztworu kwaśnego (zał. B–D), techniki zamienne (zał. E–F), identyfikacja gatunków i serogrup (zał. G), dane walidacji (zał. H) i obróbka biofilmu i osadów (zał. I) są poza nim; macierz decyzyjną (zał. J) znamy z fragmentów przytoczonych w poprawce Ap1. Skład agaru BCYE, roztworu kwaśnego i przebieg potwierdzania podajemy jako przykład z brytyjskiej metody urzędowej (The determination of Legionella bacteria in waters and other environmental samples, cz. 2, 2020), opartej na tej normie — w krokach oznaczone „przykład”.

Zasada metody

Bakterie Legionella z próbki zagęszcza się filtracją membranową, rozcieńcza albo posiewa bezpośrednio — zależnie od pochodzenia i właściwości próbki. Aby ograniczyć wzrost zagęszczonych bakterii innych niż docelowe, części próbki poddaje się obróbce cieplnej, kwasowej albo obu łącznie. Próbki z dużą liczbą Legionella lub innych bakterii rozcieńcza się, a osobne porcje rozcieńczonej próbki obrabia się jedną cieplnie, drugą roztworem kwaśnym (przy próbkach skrajnie zanieczyszczonych — roztworem kwaśnym i ciepłem) przed posiewem na podłoża selektywne. Porcje obrobione i nieobrobione przenosi się na płytki z wybranym podłożem selektywnym dla Legionella i inkubuje (p. 4.1). Po inkubacji kolonie o charakterystycznym wyglądzie uznaje się za domniemane Legionella (p. 4.2) i potwierdza subkulturą (p. 4.3); z definicji normy bakterie z rodzaju Legionella rosną na agarze z buforowanym ekstraktem drożdżowym i węglem aktywnym (BCYE) zawierającym L-cysteinę i sole żelaza(III) (p. 3.1).

Zastosowania

• Instalacje ciepłej i zimnej wody w budynkach, chłodnie wyparne, wanny z hydromasażem, unity stomatologiczne, klimatyzatory (wprowadzenie)
• Woda do spożycia w wewnętrznych systemach wodociągowych — poniżej 1000 jtk/l, w budynkach podmiotów leczniczych z pacjentami o obniżonej odporności poniżej 50 jtk/l (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. E i zał. nr 5)
• Pływalnie — woda wprowadzana do niecki, niecki z aerozolem, woda w niecce o temperaturze co najmniej 30 °C, natryski (Dz.U. 2022 poz. 1230, zał. nr 1)
• Dochodzenia przy ogniskach legionelozy — przy próbkach ze spodziewaną dużą liczbą bakterii przeszkadzających płytki ogląda się już w 2. dniu (p. 8.4.7)
• Walidacja środków kontroli i sprawdzanie ich skuteczności (wprowadzenie)
• Woda do picia, wody przemysłowe, ścieki, wody naturalne, biofilm i osady (rozdz. 1)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 11731:2017-08

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe bakterii z rodzaju Legionella

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Legionella

Procedura krok po kroku

1. Pobranie, transport i przechowanie

   Według ISO 19458; próbek nie narażać na niekorzystną temperaturę (zamarzanie, przegrzanie) — pomocne są pojemniki izolowane (rozdz. 7). Przykład (metoda brytyjska, 2020): transport i przechowywanie w 6–20 °C, analiza jak najszybciej, nie później niż w ciągu dwóch dni, najlepiej w ciągu 24 h.

2. Wybór sposobu

   Sposób dobiera się do rodzaju próbki według macierzy decyzyjnej (zał. J). Zwykle — zagęszczenie filtracją; przy spodziewanych ponad 10⁴ jtk/l można posiać próbkę niezagęszczoną; próbki silnie zanieczyszczone rozcieńczyć i posiać bezpośrednio przed obróbką i po niej. Zapisać objętości i zastosowane obróbki (p. 8.1).

3. Zagęszczenie — sączek na podłożu

   Próbkę (bez obróbki, po obróbce kwasowej i w razie potrzeby po cieplnej) przesączyć przez sączek z azotanu celulozy albo mieszanych estrów celulozy; zapisać objętość; sączek dezynfekowaną pęsetą ułożyć wierzchnią stroną do góry na podłożu, bez pęcherzyków powietrza pod spodem. Obróbkę kwasową można wykonać na sączku w lejku (p. 8.2.2).

4. Zagęszczenie z wymywaniem

   Próbkę przesączyć przez sączek poliwęglanowy albo polietersulfonowy, zapisać objętość, sączek wierzchnią stroną do dołu włożyć do jałowego pojemnika (z kulkami szklanymi albo bez), dodać 5–10 ml jałowego rozcieńczalnika albo próbki i wytrząsać energicznie na wytrząsarce co najmniej 2 min albo w łaźni ultradźwiękowej przez sprawdzony czas. Koncentrat podzielić na trzy porcje: bez obróbki, do obróbki cieplnej i do obróbki kwasowej (p. 8.2.3).

5. Obróbka cieplna

   Próbkę albo koncentrat w jałowym pojemniku trzymać w łaźni wodnej w (50 ± 1) °C przez (30 ± 2) min — czas liczy się od osiągnięcia temperatury; najlepiej objętości do 5 ml, przy wielu próbkach albo dużych objętościach temperaturę kontroluje się w osobnym pojemniku (p. 8.3.1).

   🌡 Temperatura: 50 ± 1 °C

6. Obróbka kwasowa

   Jedną objętość próbki albo koncentratu rozcieńczyć dziewięcioma objętościami roztworu kwaśnego, wymieszać i odstawić na (5,0 ± 0,5) min; rozcieńczenie uwzględnić w obliczeniu. Na sączku: ok. 30 ml roztworu kwaśnego na (5 ± 0,5) min, odsączyć i przemyć sączek co najmniej 20 ml rozcieńczalnika, nie spłukując części lejka, która nie miała kontaktu z kwasem (p. 8.3.2).

7. Posiew

   Posiać i rozprowadzić 0,1–0,5 ml każdej porcji na płytki według przypadku: duża liczba Legionella i mało flory — agar BCYE i BCYE+AB; mało Legionella i mało flory — sączek nieobrobiony na BCYE, sączek po obróbce kwasowej na BCYE+AB, GVPC albo MWY (albo porcje koncentratu na BCYE i podłoża selektywne); dużo flory — porcje nieobrobiona, po obróbce cieplnej i kwasowej na GVPC albo MWY; bardzo dużo flory — obróbka cieplna, ostudzenie, obróbka kwasowa, rozcieńczenia 1:10 i 1:100 na GVPC albo MWY. Zapisać posiane objętości (p. 8.4.2–8.4.5).

8. Inkubacja

   Po wchłonięciu inokulum płytki odwrócić i inkubować w (36 ± 2) °C przez 7–10 dni w wilgotnej atmosferze, np. w zamkniętym pojemniku. Próbki naturalne z dzikimi szczepami mogą wymagać pełnych 10 dni (p. 8.4.6).

   🌡 Temperatura: 36 ± 2 °C

9. Przeglądanie płytek

   Pierwszy przegląd w 2., 3., 4. albo 5. dniu (wykrycie przerostu), ostatni na końcu inkubacji; zalecany mikroskop stereoskopowy z ukośnym oświetleniem. Kolonie Legionella są zwykle biało-szare, gładkie, o równym brzegu i wyglądzie szkła matowego; pod lampą UV kolonie kilku gatunków (m.in. L. anisa, L. bozemanii, L. dumoffii, L. gormanii) świecą jaskrawo biało, L. erythra i L. rubrilucens — na czerwono, a L. pneumophila — matowo zielono, często z żółtym odcieniem. Zapisać liczbę kolonii domniemanych każdego typu (p. 8.4.7).

10. Potwierdzenie

    Kolonie domniemane potwierdza się subkulturą (p. 4.3; przebieg w p. 8.5, poza dostępnym tekstem normy). Przykład (metoda brytyjska, 2020): co najmniej trzy kolonie każdego typu przesiać na agar BCYE i agar BCYE bez L-cysteiny (albo agar z krwią lub odżywczy), inkubować 2–3 dni; kolonie rosnące tylko na BCYE z L-cysteiną uznaje się za Legionella. Identyfikacja gatunków i serogrup wymaga dalszych badań i nie należy do metod normy (p. 4.3, zał. G).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Osoby korzystające z normy powinny znać zwykłą praktykę laboratoryjną; norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP i zgodności z przepisami krajowymi należy do użytkownika (ostrzeżenie normy)
• Badania według normy muszą wykonywać odpowiednio wykwalifikowani i kompetentni pracownicy (ostrzeżenie normy)

Najczęstsze pytania