🐟 Histamina w rybach i produktach rybołówstwa — HPLC z derywatyzacją chlorkiem dansylu

Chemia żywności PN-EN ISO 19343

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 19343:2017-08 — wersja angielska, tytuł polski „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Wykrywanie ilościowe i oznaczanie histaminy w rybach i produktach rybnych — Metoda HPLC”, wprowadza EN ISO 19343:2017 i ISO 19343:2017 [IDT]; w katalogu PKN bez adnotacji o wycofaniu (wyszukiwarka PKN, 02.11.2026). ISO 19343:2017 to pierwsze wydanie normy (opublikowane 28.06.2017), według Standard Norge aktualne; przygotował ją CEN/TC 275 we współpracy z ISO/TC 34/SC 9. Opis opiera się na podglądzie ISO 19343:2017 (iTeh: wprowadzenie, rozdz. 1–9 bez tablicy 2) i na publikacji walidacyjnej metody (G. Duflos i in., Int. J. Food Microbiol. 2019, 288: 97–101).

WPROWADZENIE NORMY. Histamina wywołuje zatrucie skombroidowe (zatrucie histaminą z ryb). Występuje głównie w rybach makrelowatych (tuńczyk, makrela) i śledziowatych (śledź, sardynka), które zawierają dużo wolnej histydyny; powstaje przez dekarboksylację histydyny przez dekarboksylazę histydynową drobnoustrojów. Spożycie żywności ze znacznym stężeniem histaminy może wywołać objawy podobne do alergii pokarmowej. Normę opracowano, aby ujednolicić metodę wykrywania i oznaczania histaminy w rybach i produktach rybołówstwa, zwłaszcza na potrzeby rozporządzenia (WE) nr 2073/2005.

ZAKRES I ZASADA (rozdz. 1 i 4). Metoda HPLC oznaczania histaminy w rybach i produktach rybołówstwa (np. sosach rybnych, rybach dojrzewających enzymatycznie w solance) przeznaczonych do spożycia przez ludzi. Metoda oddziela histaminę od innych amin biogennych: próbkę ekstrahuje się kwasem nadchlorowym, derywatyzację przedkolumnową prowadzi chlorkiem dansylu, aminy rozdziela metodą HPLC na odpowiedniej kolumnie z detekcją UV, a stężenie histaminy oblicza ze stosunku pola piku histaminy do pola piku wzorca wewnętrznego, z krzywej kalibracyjnej.

ODCZYNNIKI (rozdz. 5). Woda klasy 1 według ISO 3696 (o ile nie podano inaczej), rozpuszczalniki do HPLC: aceton, acetonitryl, toluen; azot. Kwas nadchlorowy 0,2 mol/l (zalecany): 19,5 ml kwasu 65 % albo 17,2 ml kwasu 70 % do 1000 ml wody (trwały 6 miesięcy w temperaturze od 15 °C do 25 °C). Nasycony roztwór węglanu sodu: 110 g w około 150 ml wody (trwały 3 miesiące w 5 °C ± 3 °C). Chlorek dansylu 7,5 mg/ml: 0,375 g w 50 ml acetonu (trwały 3 tygodnie w ciemności poniżej −18 °C). L-prolina 100 mg/ml: 1 g w 10 ml wody (3 tygodnie w 5 °C ± 3 °C). Roztwór podstawowy histaminy 12,5 mg/ml: 1,034 g dichlorowodorku histaminy w 50 ml wody (rok poniżej −18 °C). Wzorzec wewnętrzny (zalecany) — 1,7-diaminoheptan 6,4 mg/ml: 0,320 g w 50 ml wody (3 tygodnie w 5 °C ± 3 °C).

APARATURA (rozdz. 6). Młynek (mikser, blender), wagi z dokładnością 0,1 g i 0,001 g, homogenizator z metalowymi prętami, wirówka chłodzona do 8 000 g, plastikowe probówki wirówkowe z zakrętkami, pipety od 20 µl do 200 µl i od 100 µl do 1 000 µl, probówki z żaroodpornego szkła z zakrętkami, wytrząsarka typu vortex, łaźnia wodna 60 °C ± 1 °C z ciemną pokrywą, chłodziarka 5 °C ± 3 °C, zamrażarka poniżej −18 °C, odparowywacz z azotem, igły 20G (0,9 mm), filtry 0,2 µm (PTFE albo PP), strzykawki 2 ml, fiolki szklane 2 ml z wkładką 200 µl. Chromatograf: pompa, chłodzony podajnik próbek, termostat kolumny 25 °C ± 2 °C, detektor UV 254 nm; kolumna C18, 5 µm, 100 Å, 25 cm × 4,6 mm albo równoważna. Można używać aparatów HPLC i UHPLC; orientacyjne warunki rozdzielania podaje informacyjny załącznik A.

PRZEBIEG (rozdz. 7). Mięso ryby homogenizuje się w mikserze; porcję 5 g ± 0,1 g przenosi się do probówki wirówkowej. Dodaje się 10 ml kwasu nadchlorowego i 100 µl roztworu 1,7-diaminoheptanu, homogenizuje, a następnie odwirowuje 5 min przy 8 000 g w 4 °C. Do probówki odmierza się 100 µl supernatantu, 300 µl roztworu węglanu sodu i 400 µl roztworu chlorku dansylu, miesza i inkubuje 5 min w ciemności w 60 °C; po ochłodzeniu pod zimną wodą dodaje się 100 µl roztworu L-proliny, miesza i trzyma 15 min w ciemności. Dodaje się 500 µl toluenu, miesza, przenosi jak najwięcej górnej fazy organicznej (zawiera pochodną histaminy) do nowej probówki i odparowuje do sucha strumieniem azotu pod wyciągiem; oddzielenie fazy organicznej ułatwia zamrożenie fazy wodnej (poniżej −18 °C, co najmniej 30 min). Suchą pozostałość rozpuszcza się w 200 µl mieszaniny acetonitrylu i wody 60/40 (V/V), miesza, przesącza przez filtr 0,2 µm do fiolki i nastrzykuje. Supernatant albo próbkę po dodaniu toluenu można przechować poniżej −18 °C najwyżej tydzień. Próbki wzorcowe przygotowuje się, dodając roztwór podstawowy histaminy do homogenatu z matrycy bez histaminy — przykładowo 0, 25, 50, 100, 250 i 500 mg/kg (0, 10, 20, 40, 100 i 200 µl) — i przeprowadzając je przez cały przebieg; kalibracja na tej samej matrycy co próbka zapobiega efektowi matrycy i obciążeniu wyniku.

WYNIK (rozdz. 8–9). Funkcję kalibracji wyznacza się regresją liniową stosunku pól pików histaminy i wzorca wewnętrznego. Stężenie histaminy w próbce: C = (A_H / A_IS) · 5 / (a · m) w mg/kg, gdzie a — nachylenie prostej kalibracji, m — masa porcji (zwykle 5 g); gdy wynik wypada poza zakresem próbek wzorcowych, analizę powtarza się z mniejszą porcją. Dla matryc złożonych albo trudnych do uzyskania bez histaminy (np. mączka rybna, sos rybny) stosuje się metodę dodatku wzorca. Granice powtarzalności i odtwarzalności wyznaczono w badaniu międzylaboratoryjnym — według publikacji walidacyjnej przeprowadzonym w 2013 r. w 9 laboratoriach z 7 krajów europejskich dla ryb dojrzewających enzymatycznie, ryb bez dojrzewania i sosu rybnego; metodę znormalizowano w ramach mandatu M381 Komisji Europejskiej.

PRZEPISY. Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany z 01.07.2026, zał. I rozdz. 1) wskazuje EN ISO 19343 jako metodę odniesienia dla kryteriów: 1.26 — produkty rybołówstwa z gatunków ryb o podwyższonym poziomie histydyny: n = 9, c = 2, m = 100 mg/kg, M = 200 mg/kg; 1.27 — takie produkty poddane enzymatycznemu dojrzewaniu w solance (z wyjątkiem 1.27a): n = 9, c = 2, m = 200 mg/kg, M = 400 mg/kg; 1.27a — sos rybny wytwarzany przez fermentację produktów rybołówstwa: n = 1, c = 0, limit 400 mg/kg; kryteria stosuje się do produktów wprowadzonych do obrotu w okresie przydatności do spożycia. Chodzi zwłaszcza o gatunki z rodzin makrelowatych (Scombridae), śledziowatych (Clupeidae), sardelowatych (Engraulidae), koryfenowatych (Coryfenidae), tasergalowatych (Pomatomidae) i makreloszowatych (Scombresosidae). Wynik dla kryteriów 1.26–1.27 jest zadowalający, gdy średnia z wartości nie przekracza m, najwyżej c z n wartości leży między m i M i żadna wartość nie przekracza M; na poziomie handlu detalicznego można pobierać pojedyncze próbki.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Orientacyjnych warunków rozdzielania HPLC (zał. A), wartości powtarzalności i odtwarzalności (tablica 2) ani charakterystyk metody, np. granicy oznaczalności (zał. B) — tych części normy nie ma w podglądzie.

Zasada metody

Porcję zhomogenizowanego mięsa ryby (5 g) ekstrahuje się 10 ml kwasu nadchlorowego 0,2 mol/l z dodatkiem 1,7-diaminoheptanu jako wzorca wewnętrznego i odwirowuje. Aminy biogenne z supernatantu przeprowadza się w pochodne z chlorkiem dansylu w środowisku nasyconego węglanu sodu (5 min w 60 °C, w ciemności), po czym dodaje się L-prolinę, a pochodne ekstrahuje toluenem, odparowuje i rozpuszcza w mieszaninie acetonitrylu z wodą.

Pochodne rozdziela się metodą HPLC na kolumnie C18 i wykrywa detektorem UV przy 254 nm. Stężenie histaminy oblicza się ze stosunku pól pików histaminy i wzorca wewnętrznego, z kalibracji wykonanej na tej samej matrycy pozbawionej histaminy (albo metodą dodatku wzorca).

Zastosowania

• Ryby i produkty rybołówstwa przeznaczone do spożycia przez ludzi, w tym sosy rybne i ryby dojrzewające enzymatycznie w solance — histamina (rozdz. 1)
• Kryteria bezpieczeństwa żywności 1.26, 1.27 i 1.27a rozporządzenia (WE) nr 2073/2005 — EN ISO 19343 jest metodą odniesienia
• Gatunki o podwyższonym poziomie histydyny: rodziny makrelowatych, śledziowatych, sardelowatych, koryfenowatych, tasergalowatych i makreloszowatych (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, przypis 17)
• Matryce złożone albo trudne do uzyskania bez histaminy (np. mączka rybna, sos rybny) — kalibracja metodą dodatku wzorca (uwaga do 8.2)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 19343:2017-08

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Wykrywanie ilościowe i oznaczanie histaminy w rybach i produktach rybnych — Metoda HPLC

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Detection and quantification of histamine in fish and fishery products — HPLC method

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Homogenizacja mięsa ryby w mikserze; porcja 5 g ± 0,1 g do probówki wirówkowej (7.1).

2. Ekstrakcja

   10 ml kwasu nadchlorowego 0,2 mol/l i 100 µl 1,7-diaminoheptanu; homogenizacja; wirowanie 5 min przy 8 000 g w 4 °C (7.2).

3. Derywatyzacja

   100 µl supernatantu, 300 µl nasyconego węglanu sodu, 400 µl chlorku dansylu; 5 min w ciemności w 60 °C; ochłodzenie, 100 µl L-proliny, 15 min w ciemności (7.3).

4. Oczyszczanie

   500 µl toluenu, wymieszanie; górna faza organiczna do nowej probówki, odparowanie azotem pod wyciągiem; pozostałość w 200 µl acetonitrylu z wodą 60/40; filtr 0,2 µm do fiolki (7.4).

5. Analiza HPLC

   Rozdzielenie na kolumnie C18 w 25 °C ± 2 °C, detekcja UV 254 nm; orientacyjne warunki — zał. A (6.16–6.17, 7.5).

6. Kalibracja

   Próbki wzorcowe z matrycy bez histaminy (np. 0–500 mg/kg) przez cały przebieg; regresja liniowa stosunku pól pików histaminy i wzorca wewnętrznego (7.6, 8.1).

7. Wynik

   C = (A_H / A_IS) · 5 / (a · m) w mg/kg; poza zakresem — powtórzenie z mniejszą porcją; ocena wobec kryteriów rozporządzenia (WE) nr 2073/2005 (8.2).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Kwas nadchlorowy 65–70 %, z którego przygotowuje się roztwór 0,2 mol/l, jest silnie utleniający i żrący — postępować według karty charakterystyki
• Toluen jest łatwopalny i szkodliwy — fazę organiczną odparowuje się strumieniem azotu pod wyciągiem (7.4); postępować według kart charakterystyki

Najczęstsze pytania