🦠 Gronkowce koagulazo-dodatnie (S. aureus)

Mikrobiologia PN-EN ISO 6888-1

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 6888-1:2022-03 — wersja angielska, opublikowana 04.03.2022, wprowadza EN ISO 6888-1:2021 i ISO 6888-1:2021 [IDT]; zastąpiła PN-EN ISO 6888-1:2001 ze ZMIANAMI A1:2004 i A2:2018-10. ZMIANA PN-EN ISO 6888-1:2022-03/A1:2024-02 (wersja angielska, opublikowana 28.02.2024) wprowadza ISO 6888-1:2021/Amd 1:2023: dodaje powołanie ISO 19036:2019 (szacowanie niepewności wyników ilościowych), każe podawać w sprawozdaniu metodę jako ISO 6888-1:2021, a w tablicy B.2 usuwa szczep WDCM 00090 z badania osocza króliczego z BHI (zostają S. aureus WDCM 00032, 00034, 00035; reakcja dodatnia — skrzep zajmuje ponad połowę objętości cieczy) i porządkuje wiersz podłoża RPFA. Wydanie z 2021 r. zmieniło inkubację z „35 °C albo 37 °C” na 34–38 °C i czas z „18–24 h” na (24 ± 2) h, wprowadziło wylewanie podłoża w 44–47 °C, podłoże RPFA jako alternatywę testu koagulazy i badanie przydatności podłoży według ISO 11133.

ZAKRES (rozdz. 1, wprowadzenie). Liczenie gronkowców koagulazo-dodatnich na podłożu Baird-Parkera po tlenowej inkubacji w 34–38 °C i potwierdzeniu koagulazy — w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt, w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością i paszami oraz w próbkach z produkcji pierwotnej. Według wiedzy z chwili publikacji metoda nie jest (w pełni) odpowiednia do produktów fermentowanych i innych z florą technologiczną opartą na Staphylococcus spp. (np. S. xylosus) — takich jak sery z mleka surowego i niektóre surowe wyroby mięsne — gdy mogą zawierać gronkowce tworzące na podłożu Baird-Parkera kolonie nietypowe albo florę towarzyszącą przesłaniającą szukane kolonie; ISO 6888-1 i ISO 6888-2 mają jednak równoważny status. Norma dotyczy głównie Staphylococcus aureus, ale także S. intermedius i niektórych szczepów S. hyicus; część szczepów S. aureus daje słabo dodatnią reakcję koagulazy — odróżniają je badania spoza normy (wrażliwość na lizostafynę, hemolizyna, termostabilna nukleaza, kwas z mannitolu).

KOLONIE (p. 9.3.1, 9.2). Typowe: czarne lub szare, lśniące i wypukłe, o średnicy 1–1,5 mm po (24 ± 2) h i 1,5–2,5 mm po (48 ± 4) h, otoczone strefą przejaśnienia, która może być częściowo nieprzejrzysta; po co najmniej 24 h może się w niej pojawić opalizujący pierścień przylegający do kolonii. Nietypowe, tej samej wielkości: lśniące czarne z wąskim białym brzegiem albo bez niego, bez strefy przejaśnienia albo ze strefą ledwie widoczną, albo szare bez strefy przejaśnienia; tworzą je głównie szczepy zanieczyszczające np. produkty mleczne, krewetki i podroby. Kolonie typowe po 24 h mogą stracić wygląd typowy po 48 h — liczenie tylko po 48 h może dać zaniżony wynik albo brak wyniku.

PODŁOŻE BAIRD-PARKERA (ISO 6888-1:1999, p. 5.3; skład w wydaniu z 2021 r. — zał. B, poza dostępnym tekstem). Podłoże podstawowe na 1 000 ml: trzustkowy hydrolizat kazeiny 10,0 g, ekstrakt drożdżowy 1,0 g, ekstrakt mięsny 5,0 g, pirogronian sodu 10,0 g, L-glicyna 12,0 g, chlorek litu 5,0 g, agar 12–22 g; pH 7,2 ± 0,2. Na 100 ml podłoża podstawowego dodaje się 1,0 ml 1-procentowego roztworu tellurynu potasu i 5,0 ml emulsji żółtka jaja (około 20 %), a przy podejrzeniu obecności Proteus — 2,5 ml roztworu sulfametazyny. Karta podłoża Baird-Parkera podaje, że chlorek litu i telluryn hamują większość flory towarzyszącej, a pirogronian i glicyna pobudzają wzrost gronkowców.

PRZEPISY. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026) wskazuje EN/ISO 6888-1 lub 2 w kryteriach higieny procesu dla gronkowców koagulazo-dodatnich (n = 5, c = 2): sery z mleka poddanego obróbce w temperaturze niższej niż pasteryzacja i sery dojrzewające z mleka lub serwatki pasteryzowanych — m = 100, M = 1 000 jtk/g (pkt 2.2.4), sery niedojrzewające (świeże) z mleka lub serwatki pasteryzowanych — 10 i 100 jtk/g (pkt 2.2.5), mleko i serwatka w proszku — 10 i 100 jtk/g (pkt 2.2.7), produkty z gotowanych skorupiaków i mięczaków bez skorup i muszli — 100 i 1 000 jtk/g (pkt 2.4.1). Dla serów z mleka surowego (10⁴ i 10⁵ jtk/g, pkt 2.2.3) metodą referencyjną jest EN/ISO 6888-2. Przy wartościach powyżej 10⁵ jtk/g partię bada się na obecność enterotoksyn gronkowcowych (kryterium 1.21: niewykrywane w 25 g, metoda EN ISO 19020). Według rozdziału 12 podręcznika BAM (FDA) S. aureus łatwo ginie podczas obróbki cieplnej, więc jego obecność w żywności przetworzonej zwykle świadczy o złej higienie, a zanieczyszczenie po obróbce wynika zwykle z kontaktu z człowiekiem albo z zanieczyszczonymi powierzchniami stykającymi się z żywnością.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst wydania z 2021 r. kończy się na p. 9.3.2 (wybór płytek do liczenia). Wyboru kolonii do potwierdzenia, przebiegu testu koagulazy w probówce i testu na podłożu RPFA (p. 9.4), obliczeń (rozdz. 10), składu podłoży i odczynników z zał. B oraz danych precyzji (rozdz. 11) nie podajemy; skład podłoża Baird-Parkera — według wydania z 1999 r.

Zasada metody

Powierzchnię stałego podłoża selektywnego (Baird-Parkera) posiewa się określoną ilością próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej i kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych, płytki inkubuje się tlenowo w 34–38 °C i ogląda po 24 h i po 48 h (p. 4.1–4.2). Liczbę gronkowców koagulazo-dodatnich w 1 g, 1 ml, 1 cm² albo na urządzenie do pobierania próbek oblicza się z liczby kolonii typowych i nietypowych na płytkach z rozcieńczeń dających wynik znaczący, potwierdzonych dodatnim testem koagulazy — w probówce albo na podłożu z fibrynogenem i osoczem króliczym (RPFA) (p. 3.1, 4.3).

Zastosowania

• Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1)
• Próbki środowiskowe z produkcji i obrotu żywnością i paszami oraz próbki z produkcji pierwotnej (rozdz. 1)
• Sery dojrzewające i sery z mleka poddanego obróbce w temperaturze niższej niż pasteryzacja, sery świeże, mleko i serwatka w proszku — kryteria higieny procesu (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.2.4, 2.2.5, 2.2.7)
• Produkty z gotowanych skorupiaków i mięczaków bez skorup i muszli (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.4.1)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 6888-1:2022-03 + A1:2024-02

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) — Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej Baird-Parkera

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 1: Method using Baird-Parker agar medium

Procedura krok po kroku

1. Próbka i rozcieńczenia

   Próbkę do badań, zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia przygotowuje się według właściwej części ISO 6887, a w razie potrzeby ISO 18593 (rozdz. 8, p. 9.1). Pobieranie próbek nie jest częścią metody — zalecane normy: ISO/TS 17728, ISO 707, ISO 6887-3, ISO 13307, ISO 17604, ISO 18593 (rozdz. 7).

2. Posiew

   Jałową pipetą przenieść 0,1 ml próbki ciekłej albo 0,1 ml zawiesiny wyjściowej (10⁻¹) na płytkę z agarem Baird-Parkera; powtórzyć z kolejnymi rozcieńczeniami dziesiętnymi; liczba płytek na rozcieńczenie — według ISO 7218. Przy małych liczbach gronkowców — 1,0 ml na płytkę 140 mm albo na trzy płytki 90 mm (p. 9.2).

3. Rozprowadzenie

   Inokulum rozprowadzić głaszczką jak najszybciej po powierzchni, nie dotykając ścianek płytki; płytki z pokrywkami zostawić do wyschnięcia na około 15 min w temperaturze pokojowej (p. 9.2).

4. Inkubacja

   Płytki odwrócić i inkubować (24 ± 2) h w 34–38 °C, potem łącznie (48 ± 4) h (p. 9.2).

   🌡 Temperatura: 34–38 °C

5. Odczyt po 24 h i 48 h

   Po (24 ± 2) h zaznaczyć na dnie płytek położenie kolonii typowych; po kolejnych (24 ± 2) h zaznaczyć nowe kolonie typowe oraz kolonie nietypowe (p. 9.3.2).

6. Wybór płytek

   Do liczenia zachować płytki z dwóch kolejnych rozcieńczeń, mające najwyżej 300 kolonii ogółem (typowe, nietypowe i flora towarzysząca), w tym najwyżej 150 kolonii typowych i/lub nietypowych (p. 9.3.2).

7. Potwierdzenie

   Kolonie typowe i nietypowe potwierdza się testem koagulazy w probówce albo na podłożu RPFA (p. 3.1, 9.4); preparat barwiony metodą Grama przed potwierdzeniem pozwala odróżnić od gronkowców bakterie innych rodzajów (uwaga w p. 9.3.1.2). Przebieg potwierdzenia — p. 9.4, poza dostępnym tekstem.

8. Wynik

   Liczbę gronkowców koagulazo-dodatnich podaje się w 1 g, 1 ml, 1 cm² albo na urządzenie do pobierania próbek (p. 3.2); obliczenia — rozdz. 10 i ISO 7218; niepewność — według ISO 19036:2019, rozdz. 9, gdy jest potrzebna albo zamówiona (zmiana A1, rozdz. 12).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Badania na obecność gronkowców prowadzi się tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach, pod nadzorem doświadczonego mikrobiologa, z dużą starannością przy usuwaniu wszystkich inkubowanych materiałów (ostrzeżenie normy)
• Norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP należy do użytkownika (ostrzeżenie normy)

Najczęstsze pytania