🦠 Enterokoki kałowe w wodzie

Mikrobiologia PN-EN ISO 7899-2

Przegląd

STATUS (stan na 29.10.2026). PN-EN ISO 7899-2:2004 — wersja polska, opublikowana 14.04.2004, wprowadza EN ISO 7899-2:2000 [IDT] i ISO 7899-2:2000 [IDT]; zastąpiła angielską wersję PN-EN ISO 7899-2:2002. Norma aktualna — bez adnotacji o wycofaniu. ISO 7899-2:2000 (wydanie drugie) zastąpiło wydanie z 1984 r. po rewizji technicznej i ma w katalogu status normy obowiązującej.

ZAKRES (rozdz. 1). Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków jelitowych (w polskiej wersji normy: enterokoków kałowych) w wodzie metodą filtracji membranowej — szczególnie w wodzie do picia, wodzie z basenów oraz innych wodach dezynfekowanych lub czystych. Metodę można stosować do wszystkich rodzajów wód, z wyjątkiem próbek z dużą ilością zawiesiny albo z wieloma mikroorganizmami przeszkadzającymi; szczególnie nadaje się do badania dużych objętości wody zawierających niewiele enterokoków. Część 1 tej serii to miniaturowa metoda najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) dla wód powierzchniowych i ścieków.

CO OZNACZA METODA (rozdz. 3, wprowadzenie). Enterokoki jelitowe to bakterie, które na podłożach z p. 6.3.1 i 6.3.2 redukują chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy do formazanu i hydrolizują eskulinę w 44 °C. Metoda wykrywa Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans i E. hirae, a okazjonalnie także inne gatunki Enterococcus i niektóre gatunki Streptococcus (S. bovis, S. equinus) — te ostatnie krótko przeżywają w wodzie i prawdopodobnie nie są liczone ilościowo. W badaniu wody enterokoki traktuje się jako wskaźnik zanieczyszczenia kałowego, choć część enterokoków w wodzie może pochodzić z innych środowisk.

PRZEPISY. Woda do spożycia: enterokoki jelitowe 0 w 100 ml (w wodzie rozlewanej do butelek lub pojemników — w 250 ml) (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. A tab. 1); razem z E. coli to „parametry podstawowe”, których częstotliwości monitorowania nie zmniejsza się (zał. nr 3 cz. I). PN-EN ISO 7899-2 jest metodą referencyjną (zał. nr 4 cz. A), a metoda Enterolert-DW — metodą alternatywną uznaną za równoważną (zał. nr 4 cz. C). Kąpieliska: enterokoki jelitowe w jtk/100 ml — wody śródlądowe: jakość doskonała 200, dobra 400 (95. percentyl), dostateczna 330 (90. percentyl); wody przybrzeżne i przejściowe: 100, 200 i 185; metody referencyjne ISO 7899-1 albo ISO 7899-2 (dyrektywa 2006/7/WE, zał. I).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się na p. 6.3.1.2 (roztwór TTC). Przygotowanie kompletnego podłoża Slanetza i Bartleya (dodatek TTC), skład agaru z żółcią, eskuliną i azydkiem (p. 6.3.2), pobieranie próbek (rozdz. 7), przebieg oznaczenia (rozdz. 8), zapewnienie jakości (rozdz. 9) i wyrażanie wyników (rozdz. 10) są poza nim. Czas inkubacji na podłożu Slanetza i Bartleya (44 ± 4) h oraz potwierdzanie w (44 ± 0,5) °C przez 2 h podajemy za kartą podłoża wytwarzanego zgodnie z normą — dostępny tekst normy podaje temperatury cieplarek i to, że enterokoki jelitowe hydrolizują eskulinę w 2 h.

Zasada metody

Określoną objętość próbki przesącza się przez sączek membranowy o wielkości porów 0,45 µm, który zatrzymuje bakterie. Sączek układa się na stałym podłożu selektywnym z azydkiem sodu (hamuje wzrost bakterii Gram-ujemnych) i bezbarwnym chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliowym (TTC), który enterokoki jelitowe redukują do czerwonego formazanu. Typowe kolonie są wypukłe, czerwone, bordowe albo różowe — w środku albo na całej powierzchni (p. 4.1). Jeżeli wyrosły kolonie typowe, sączek ze wszystkimi koloniami przenosi się na agar z żółcią, eskuliną i azydkiem ogrzany wcześniej do 44 °C: enterokoki jelitowe hydrolizują na nim eskulinę w ciągu 2 h, a produkt hydrolizy — 6,7-dihydroksykumaryna — tworzy z jonami żelaza(III) związek o barwie od jasnobrązowej do czarnej, który dyfunduje do podłoża (p. 4.2).

Zastosowania

• Woda do picia, woda z basenów oraz inne wody dezynfekowane lub czyste (rozdz. 1)
• Duże objętości wody zawierające niewiele enterokoków jelitowych (rozdz. 1)
• Woda do spożycia — enterokoki jelitowe 0 w 100 ml, w wodzie rozlewanej do butelek lub pojemników 0 w 250 ml; metoda referencyjna (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. A i zał. nr 4 cz. A)
• Kąpieliska — ocena jakości wody, metoda referencyjna obok ISO 7899-1 (dyrektywa 2006/7/WE, zał. I)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 7899-2:2004

Tytuł (PL)

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 2: Metoda filtracji membranowej

Title (EN)

Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 2: Membrane filtration method

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie podłoża podstawowego

   Składniki podłoża Slanetza i Bartleya rozpuścić we wrzącej wodzie, po rozpuszczeniu ogrzewać jeszcze 5 min i ostudzić do 50–60 °C; roztwór TTC przygotować osobno i sterylizować sączeniem (p. 6.3.1.1–6.3.1.2). Połączenie składników — p. 6.3.1.3, poza dostępnym tekstem normy.

2. Filtracja

   Określoną objętość próbki przesączyć przez jałowy sączek 0,45 µm w zestawie do filtracji według ISO 8199 (p. 4.1, 5.1–5.2). Dla wody do spożycia wartość parametryczna dotyczy 100 ml, dla wody rozlewanej do butelek lub pojemników — 250 ml (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. A).

3. Inkubacja na podłożu Slanetza i Bartleya

   Sączek ułożyć na podłożu i inkubować w (36 ± 2) °C (p. 5.3) — przez (44 ± 4) h według karty podłoża wytwarzanego zgodnie z normą.

   🌡 Temperatura: 36 ± 2 °C

4. Odczyt kolonii typowych

   Za typowe uznaje się kolonie wypukłe, czerwone, bordowe albo różowe w środku lub na całej powierzchni (p. 4.1).

5. Potwierdzenie na agarze z żółcią, eskuliną i azydkiem

   Gdy są kolonie typowe, sączek ze wszystkimi koloniami przenieść na agar z żółcią, eskuliną i azydkiem ogrzany do 44 °C i inkubować w (44 ± 0,5) °C. Enterokoki jelitowe hydrolizują eskulinę w ciągu 2 h — wokół kolonii powstaje zabarwienie od jasnobrązowego do czarnego, dyfundujące do podłoża (p. 4.2, 5.4).

   🌡 Temperatura: 44 ± 0,5 °C

6. Wynik

   Liczba kolonii potwierdzonych w przesączonej objętości; zasady obliczania i wyrażania wyniku — rozdz. 10 normy i ISO 8199, poza dostępnym tekstem.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Azydek sodu jest silnie toksyczny i mutagenny — unikać kontaktu, zwłaszcza wdychania drobnego pyłu przy przygotowywaniu podłoży odwodnionych (p. 6.1)
• Podłoży z azydkiem nie mieszać z mocnymi kwasami nieorganicznymi — może powstać toksyczny azotowodór (HN₃) (p. 6.1)
• Roztwory azydków w kontakcie z metalowymi rurami (np. zlewów) mogą tworzyć związki wybuchowe; azydki rozkłada się bezpiecznie nadmiarem nasyconego roztworu azotynu (p. 6.1)

Najczęstsze pytania