🦠 Enterobacteriaceae w żywności
Krótko: o co chodzi
Oznaczanie liczby Enterobacteriaceae w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt oraz w próbkach środowiskowych metodą posiewu zalewowego na agarze VRBG z nakładką, z inkubacją w 37 °C przez 24 h i potwierdzeniem testem oksydazy i fermentacji glukozy. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 21528-2:2017-08; Podłoże: agar VRBG (fiolet krystaliczny, czerwień obojętna, żółć, glukoza), skład według zał. A (p. 9.3.2). Procedura obejmuje 10 kroków; stosuje się je m.in. do: Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1), Próbki środowiskowe z produkcji pierwotnej, produkcji i obrotu żywnością (rozdz. 1), Tusze wołowe, baranie, kozie, końskie i wieprzowe — kryteria higieny procesu (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.1.1–2.1.2).
W skrócie
- Norma: PN-EN ISO 21528-2:2017-08
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 10
- Podłoże: agar VRBG (fiolet krystaliczny, czerwień obojętna, żółć, glukoza), skład według zał. A (p. 9.3.2)
- Posiew: zalewowy: 1 ml próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej na płytkę, jedna płytka na rozcieńczenie (dwie, gdy używa się tylko zawiesiny wyjściowej); około 15 ml podłoża w 44–47 °C, najpóźniej 15 min po zaszczepieniu (p. 9.3.1–9.3.2)
- Nakładka: około 5–10 ml tego samego podłoża — zapobiega rozpełzaniu i daje warunki półbeztlenowe (p. 9.3.3)
Przegląd
STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 21528-2:2017-08 — wersja angielska opublikowana 23.08.2017, wersja polska 18.10.2019; wprowadza EN ISO 21528-2:2017 i ISO 21528-2:2017 [IDT], zastąpiła PN-ISO 21528-2:2005, bez adnotacji o wycofaniu. ISO 21528-2:2017 (wydanie drugie, 16.06.2017) zastąpiło wydanie z 2004 r.: w potwierdzeniu agar glukozowy zastąpiono podłożem glukozowym OF, dodano dane precyzji (zał. B); wersja poprawiona dodała łaźnię 44–47 °C i obniżyła temperaturę podłoża w p. 9.3.2 z 47–50 °C do 44–47 °C. Zmiany uznano za drobne (ISO 17468).
ZAKRES I DEFINICJA (rozdz. 1, p. 3.1). Liczenie Enterobacteriaceae w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt oraz w próbkach środowiskowych z produkcji pierwotnej, produkcji i obrotu żywnością — gdy spodziewana liczba kolonii przekracza 100 w 1 ml albo 1 g; przy mniejszych liczbach stosuje się zwykle metodę najbardziej prawdopodobnej liczby z ISO 21528-1. Enterobacteriaceae to drobnoustroje tworzące charakterystyczne kolonie na agarze z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i glukozą (VRBG), fermentujące glukozę i dające ujemną reakcję oksydazy.
TEMPERATURA (p. 4.2, uwaga). 37 °C stosuje się zwykle, gdy oznaczenie służy jako wskaźnik higieny; 30 °C można wybrać, gdy badanie prowadzi się do celów technologicznych i ma objąć psychrotrofowe Enterobacteriaceae.
LICZENIE I POTWIERDZENIE (p. 9.4–9.6). Kolonie charakterystyczne są różowe do czerwonych albo purpurowe, ze strefą precypitatu albo bez. Liczy się je na płytkach z mniej niż 150 koloniami charakterystycznymi i z każdej płytki wybiera losowo pięć do potwierdzenia (gdy jest ich mniej — wszystkie); kolonie rozpełzające liczy się jako pojedyncze, a gdy zarastają ponad jedną czwartą płytki, wynik z płytki się odrzuca. Niektóre Enterobacteriaceae odbarwiają kolonie lub podłoże — gdy nie ma kolonii charakterystycznych, potwierdza się pięć kolonii białawych. Za Enterobacteriaceae uznaje się kolonie oksydazoujemne i glukozododatnie.
PRZEPISY. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026) wskazuje EN ISO 21528-2 w kryteriach higieny procesu: tusze wołowe, baranie, kozie i końskie — dzienna średnia logarytmiczna m = 1,5, M = 2,5 log jtk/cm² (pkt 2.1.1), tusze wieprzowe — 2,0 i 3,0 log jtk/cm² (pkt 2.1.2), mleko pasteryzowane i inne pasteryzowane płynne produkty mleczne — 10 jtk/ml (n = 5, c = 0, pkt 2.2.1), mleko i serwatka w proszku — 10 jtk/g (n = 5, c = 0, pkt 2.2.7), lody i mrożone desery mleczne — 10 i 100 jtk/g (n = 5, c = 2, pkt 2.2.8), produkty jajeczne — 10 i 100 jtk/g lub ml (n = 5, c = 2, pkt 2.3.1). Dla preparatów w proszku do żywienia niemowląt kryterium brzmi „nie wykryto w 10 g”, a metodą referencyjną jest EN ISO 21528-1, nie ta część normy (pkt 2.2.9–2.2.10).
CZEGO TU NIE PODAJEMY. Przepisów przygotowania podłoży i odczynników (zał. A — agar VRBG, podłoże glukozowe OF, odczynnik oksydazowy) nie ma w dostępnym tekście normy — nie podajemy ich; skład agaru VRBG podajemy według karty podłoża wytwarzanego zgodnie z normą. Obliczeń norma nie opisuje: odsyła do ISO 7218.
Zasada metody
Z próbki przygotowuje się zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne (p. 4.1). Agar VRBG zaszczepia się określoną ilością próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej i kolejnych rozcieńczeń, przykrywa warstwą tego samego podłoża i inkubuje w 37 °C (albo 30 °C) przez 24 h (p. 4.2). Kolonie przypuszczalne przesiewa się na podłoże nieselektywne i potwierdza testami fermentacji glukozy i obecności oksydazy (p. 4.3); liczbę Enterobacteriaceae w 1 ml albo 1 g oblicza się z liczby potwierdzonych kolonii charakterystycznych na płytce (p. 4.4).
Zastosowania
- Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1)
- Próbki środowiskowe z produkcji pierwotnej, produkcji i obrotu żywnością (rozdz. 1)
- Tusze wołowe, baranie, kozie, końskie i wieprzowe — kryteria higieny procesu (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.1.1–2.1.2)
- Mleko pasteryzowane i inne pasteryzowane płynne produkty mleczne, mleko i serwatka w proszku, lody i mrożone desery mleczne, produkty jajeczne (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.2.1, 2.2.7, 2.2.8, 2.3.1)
- Badania do celów technologicznych obejmujące psychrotrofowe Enterobacteriaceae — inkubacja w 30 °C (p. 4.2, uwaga)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Podłoże | agar VRBG (fiolet krystaliczny, czerwień obojętna, żółć, glukoza), skład według zał. A (p. 9.3.2) |
| Posiew | zalewowy: 1 ml próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej na płytkę, jedna płytka na rozcieńczenie (dwie, gdy używa się tylko zawiesiny wyjściowej); około 15 ml podłoża w 44–47 °C, najpóźniej 15 min po zaszczepieniu (p. 9.3.1–9.3.2) |
| Nakładka | około 5–10 ml tego samego podłoża — zapobiega rozpełzaniu i daje warunki półbeztlenowe (p. 9.3.3) |
| Inkubacja | 37 °C (albo 30 °C), (24 ± 2) h, płytki odwrócone (p. 9.3.4) |
| Kolonie charakterystyczne | różowe do czerwonych albo purpurowe, ze strefą precypitatu albo bez; liczy się płytki z mniej niż 150 koloniami (p. 9.4) |
| Potwierdzenie | 5 losowych kolonii z płytki: przesiew na agar nieselektywny, test oksydazy (ujemny), fermentacja w podłożu glukozowym OF (dodatnia) (p. 9.5–9.6) |
| Wynik | jtk w 1 g, 1 ml, 1 cm² albo na urządzenie do pobierania próbek; obliczenia według ISO 7218 (rozdz. 10) |
| Powtarzalność | r = 0,37 jako różnica logarytmów dziesiętnych dwóch wyników (p. 11.2) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 21528-2:2017-08
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 2: Metoda liczenia kolonii
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique
Procedura krok po kroku
-
Próbka i rozcieńczenia
Zawiesinę wyjściową i jeden szereg rozcieńczeń dziesiętnych przygotowuje się według ISO 6887 (p. 9.2). Pobieranie próbek nie jest częścią metody — zalecane normy: ISO/TS 17728, ISO 13307, ISO 17604, ISO 18593 (rozdz. 7).
-
Posiew
Do jałowej płytki Petriego przenieść 1 ml próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej; powtórzyć z kolejnymi rozcieńczeniami, każdorazowo nową jałową pipetą; gdy używa się tylko zawiesiny wyjściowej — dwie płytki (p. 9.3.1).
-
Zalanie podłożem
Dodać około 15 ml agaru VRBG schłodzonego w łaźni do 44–47 °C — najpóźniej 15 min po zaszczepieniu płytek; wymieszać ruchami poziomymi i zostawić do zestalenia na chłodnej powierzchni (p. 9.3.2).
-
Nakładka
Po całkowitym zestaleniu wlać około 5–10 ml tego samego podłoża, aby zapobiec rozpełzaniu kolonii i uzyskać warunki półbeztlenowe; zostawić do zestalenia (p. 9.3.3).
-
Inkubacja
Płytki odwrócić i inkubować w 37 °C przez (24 ± 2) h (p. 9.3.4).
-
Liczenie i wybór kolonii
Na płytkach z mniej niż 150 koloniami charakterystycznymi (różowe do czerwonych albo purpurowe, ze strefą precypitatu albo bez) policzyć je i wybrać losowo pięć do potwierdzenia (gdy mniej — wszystkie); kolonie rozpełzające liczyć jak pojedyncze, przy zarośnięciu ponad 1/4 płytki — odrzucić wynik; bez kolonii charakterystycznych — wybrać pięć kolonii białawych (p. 9.4).
-
Przesiew
Wybrane kolonie posiać na podsuszony agar nieselektywny tak, by uzyskać kolonie izolowane, inkubować w 37 °C przez (24 ± 2) h i z każdej płytki wziąć dobrze izolowaną kolonię (p. 9.5).
-
Test oksydazy
Część kolonii przenieść ezą lub drutem z platyny z irydem albo bagietką na bibułę zwilżoną odczynnikiem oksydazowym; reakcja ujemna — barwa nie zmienia się na granatowofioletową w ciągu 10 s (p. 9.6.1).
-
Fermentacja glukozy
Kolonie oksydazoujemne posiać kłutym do podłoża glukozowego OF, przykryć warstwą jałowego oleju mineralnego grubości co najmniej 1 cm i inkubować w 37 °C przez (24 ± 2) h; żółta barwa w całej probówce — reakcja dodatnia (p. 9.6.2).
-
Wynik
Kolonie oksydazoujemne i glukozododatnie potwierdza się jako Enterobacteriaceae; liczbę podaje się w jtk na 1 g, 1 ml, 1 cm² albo urządzenie do pobierania próbek, obliczoną według ISO 7218 (p. 9.6.3, rozdz. 10).
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Aparat do sterylizacji na sucho (suszarka) albo parą (autoklaw) | według ISO 7218 (p. 6.1) | — |
| Cieplarka | (37 ± 1) °C albo (30 ± 1) °C (p. 6.2) | — |
| Suszarka z wymuszonym obiegiem albo cieplarka | 25–50 °C (p. 6.3) | — |
| Łaźnie wodne | jedna utrzymująca 47–50 °C, druga 44–47 °C (p. 6.4) | — |
| Probówki albo kolby | o odpowiedniej pojemności (p. 6.5) | — |
| Płytki Petriego | szklane lub plastikowe, o średnicy około 90 mm i (opcjonalnie) około 140 mm (p. 6.6) | — |
| Ezy i druty | ezy o średnicy około 3 mm i druty z platyny z irydem albo z niklu z chromem, bagietki szklane albo jałowe ezy i igły jednorazowe; do testu oksydazy nie używa się ezy ani drutu z niklu z chromem (p. 6.7, 9.6.1) | — |
| Pipety | wielomiarowe albo automatyczne, o pojemności 10 ml, 1 ml i 0,1 ml (p. 6.8) | — |
| pH-metr | dokładność ± 0,1 pH w 25 °C (p. 6.9) | — |
| Homogenizator | według ISO 7218 (p. 6.10) | — |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Agar VRBG (z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i glukozą) | — | podłoże do posiewu i nakładki; skład według karty podłoża wytwarzanego zgodnie z normą: na 1 000 ml enzymatyczny hydrolizat tkanek zwierzęcych 7,0 g, ekstrakt drożdżowy 3,0 g, chlorek sodu 5,0 g, sole żółciowe nr 3 1,5 g, glukoza 10,0 g, czerwień obojętna 0,03 g, fiolet krystaliczny 0,002 g, agar 9–18 g, pH 7,4 ± 0,2; rozpuszcza się przez zagotowanie, bez autoklawowania; do badania podłoża karta podaje E. coli WDCM 00013 i 00012 (kolonie różowe do czerwonych, ze strefą precypitacji albo bez) i Enterococcus faecalis (zahamowany); przygotowanie według normy — zał. A.2, poza dostępnym tekstem |
| Agar nieselektywny | — | do przesiewu wybranych kolonii, suszony przed użyciem (p. 9.5, zał. A.3) |
| Odczynnik oksydazowy | — | na bibułę albo krążki lub pałeczki handlowe; reakcja ujemna — bibuła nie zmienia barwy na granatowofioletową w ciągu 10 s (p. 9.6.1, zał. A.5) |
| Podłoże glukozowe OF | — | do testu fermentacji, pod warstwą jałowego oleju mineralnego grubości co najmniej 1 cm (p. 9.6.2, zał. A.4, A.6) |
| Rozcieńczalnik | — | według ISO 6887 (rozdz. 5, p. 9.2) |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Badania na obecność Enterobacteriaceae prowadzi się tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach, pod nadzorem doświadczonego mikrobiologa, z dużą starannością przy usuwaniu wszystkich inkubowanych materiałów (ostrzeżenie normy)
- Norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP należy do użytkownika (ostrzeżenie normy)
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 21528-2:2017-08 — „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 2: Metoda liczenia kolonii”. Tytuł angielski: „Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique”.
Na czym polega ta metoda?
Z próbki przygotowuje się zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne (p. 4.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Podłoże: agar VRBG (fiolet krystaliczny, czerwień obojętna, żółć, glukoza), skład według zał. A (p. 9.3.2); Posiew: zalewowy: 1 ml próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej na płytkę, jedna płytka na rozcieńczenie (dwie, gdy używa się tylko zawiesiny wyjściowej); około 15 ml podłoża w 44–47 °C, najpóźniej 15 min po zaszczepieniu (p. 9.3.1–9.3.2); Nakładka: około 5–10 ml tego samego podłoża — zapobiega rozpełzaniu i daje warunki półbeztlenowe (p. 9.3.3); Inkubacja: 37 °C (albo 30 °C), (24 ± 2) h, płytki odwrócone (p. 9.3.4).
Ile trwa wykonanie badania?
Procedura obejmuje 10 kroków. Norma nie podaje czasu trwania dla wszystkich etapów — decyduje procedura laboratorium.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Aparat do sterylizacji na sucho (suszarka) albo parą (autoklaw), Cieplarka, Suszarka z wymuszonym obiegiem albo cieplarka, Łaźnie wodne, Probówki albo kolby, Płytki Petriego, Ezy i druty, Pipety, pH-metr, Homogenizator.
Gdzie stosuje się to badanie?
Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1); Próbki środowiskowe z produkcji pierwotnej, produkcji i obrotu żywnością (rozdz. 1); Tusze wołowe, baranie, kozie, końskie i wieprzowe — kryteria higieny procesu (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.1.1–2.1.2); Mleko pasteryzowane i inne pasteryzowane płynne produkty mleczne, mleko i serwatka w proszku, lody i mrożone desery mleczne, produkty jajeczne (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.2.1, 2.2.7, 2.2.8, 2.3.1); Badania do celów technologicznych obejmujące psychrotrofowe Enterobacteriaceae — inkubacja w 30 °C (p. 4.2, uwaga).
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Badania na obecność Enterobacteriaceae prowadzi się tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach, pod nadzorem doświadczonego mikrobiologa, z dużą starannością przy usuwaniu wszystkich inkubowanych materiałów (ostrzeżenie normy); Norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP należy do użytkownika (ostrzeżenie normy).
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 21528-2.