💊 Test endotoksyn bakteryjnych (LAL)

Farmacja i kosmetyki Ph.Eur. 2.6.14

Przegląd

STATUS (stan na 03.11.2026). Rozdział ogólny Ph. Eur. 2.6.14 „Bacterial endotoxins” obowiązuje w brzmieniu 12. wydania Farmakopei Europejskiej (wersja 12.3 w mocy od 1.07.2026). Tekst jest zharmonizowany w Pharmacopoeial Discussion Group z rozdziałem JP 4.01 i USP <85>; według wytycznej ICH Q4B Annex 14 (krok 4, 18.10.2012) teksty trzech farmakopei można stosować zamiennie, a ich wzorce endotoksyny — kalibrowane względem wzorca międzynarodowego WHO — uznaje się za równoważne. Karta uzgodnienia PDG z kwietnia 2026 r. dodaje do tekstu europejskiego — jako część niezharmonizowaną — metodę G: fluorymetryczną metodę punktu końcowego z rekombinowanym czynnikiem C (rFC). W wydaniu 13.1 (w mocy od 1.01.2027) rozdział 2.6.14 jest zrewidowany, a rozdział 2.6.32 o badaniu endotoksyn z rekombinowanym czynnikiem C zostaje z tym dniem wycofany. Opis poniżej podaje zharmonizowaną treść rozdziału (wersja PDG z kwietnia 2026 r.).

ZASADA I TECHNIKI. Test wykrywa albo oznacza ilościowo endotoksyny bakterii Gram-ujemnych lizatem amebocytów skrzypłocza (Limulus polyphemus albo Tachypleus tridentatus). Technika żelowa opiera się na tworzeniu żelu, turbidymetryczna — na narastaniu zmętnienia po rozszczepieniu substratu endogennego, chromogenna — na powstawaniu barwy po rozszczepieniu syntetycznego kompleksu peptyd–chromogen. Można stosować każdą z trzech technik; w razie wątpliwości lub sporu decyduje żelowy test graniczny, jeśli monografia produktu nie stanowi inaczej. Endotoksyny wyraża się w jednostkach endotoksyny (EU); jedna jednostka międzynarodowa (IU) endotoksyny równa się 1 EU. Lizat reaguje też z niektórymi β-glukanami — przy glukanach można stosować lizaty bez czynnika G albo z zablokowanym układem czynnika G.

APARATURA I ODCZYNNIKI (rozdz. 1–5). Szkło i inne materiały odporne na ciepło depirogenizuje się w suszarce zwalidowanym procesem — powszechnie co najmniej 30 min w 250 °C; sprzęt z tworzyw (mikropłytki, końcówki pipet) musi być wolny od wykrywalnych endotoksyn i nie może zakłócać testu. Test prowadzi się tak, aby uniknąć zanieczyszczenia endotoksynami. Lizat rozpuszcza się delikatnym mieszaniem w wodzie do badania endotoksyn albo w buforze zalecanym przez producenta; wodą do badania jest woda do wstrzykiwań albo inna woda, która nie reaguje z użytym lizatem na granicy wykrywalności odczynnika. Roztwór podstawowy wzorca przygotowuje się z wzorca endotoksyny kalibrowanego względem aktualnego wzorca międzynarodowego WHO, rozcieńczenia wykonuje w wodzie do badania i zużywa możliwie szybko. pH mieszaniny lizatu z roztworem próbki ma mieścić się w zakresie podanym przez producenta lizatu, zwykle 6,0–8,0.

MAKSYMALNE ROZCIEŃCZENIE I LIMIT (rozdz. 6). MVD = limit endotoksyn × stężenie roztworu próbki / λ, gdzie λ to deklarowana czułość lizatu w technice żelowej albo najniższe stężenie krzywej wzorcowej w technikach turbidymetrycznej i chromogennej. Limit endotoksyn dla leków pozajelitowych, określany na podstawie dawki, wynosi K/M: K to progowa dawka pirogenna endotoksyny na kilogram masy ciała, M — maksymalna zalecana dawka bolusowa produktu na kilogram masy ciała, a przy wstrzykiwaniu w krótkich odstępach albo wlewie ciągłym — maksymalna dawka całkowita podana w ciągu godziny. Limit dla produktu podaje monografia szczegółowa, np. w EU/ml albo EU/mg.

TECHNIKA ŻELOWA (rozdz. 7). Deklarowaną czułość lizatu λ potwierdza się w czterech powtórzeniach roztworami 2λ, λ, 0,5λ i 0,25λ przy każdej nowej serii lizatu i przy zmianie warunków; równe objętości roztworu lizatu i roztworu wzorca (np. po 0,1 ml) inkubuje się zwykle 60 ± 2 min w 37 ± 1 °C bez wstrząsów i odwraca probówkę jednym płynnym ruchem o około 180° — trwały żel to wynik dodatni. Czułość jest potwierdzona, gdy średnia geometryczna punktów końcowych mieści się w zakresie 0,5λ–2λ. Badanie czynników zakłócających (roztwory A–D z tablicy 1) prowadzi się na próbce bez wykrywalnych endotoksyn, rozcieńczonej mniej niż do MVD; zakłócenia usuwa się większym rozcieńczeniem nieprzekraczającym MVD, czulszym lizatem albo obróbką (sączenie, zobojętnienie, dializa, ogrzewanie), sprawdzając, że obróbka nie powoduje utraty endotoksyn. W teście granicznym próbka spełnia wymagania, gdy oba powtórzenia roztworu A są ujemne, przy dodatnich kontrolach B i C i ujemnej kontroli D; wynik rozbieżny wymaga powtórzenia. Test ilościowy oznacza endotoksyny miareczkowaniem do punktu końcowego w szeregu rozcieńczeń 1, 1/2, 1/4 i 1/8.

TECHNIKI FOTOMETRYCZNE (rozdz. 8). Technika turbidymetryczna i chromogenna, każda w wariancie punktu końcowego albo kinetycznym (czas do osiągnięcia ustalonej absorbancji albo szybkość zmian), zwykle w 37 ± 1 °C. Dla każdej serii lizatu krzywą wzorcową wyznacza się z co najmniej trzech stężeń w co najmniej trzech powtórzeniach, a bezwzględna wartość współczynnika korelacji ma wynosić co najmniej 0,980; przy zakresie większym niż dwa rzędy wielkości w metodach kinetycznych dodaje się wzorce pośrednie. Odzysk endotoksyny dodanej do próbki ma wynosić 50–200 %. Próbka spełnia wymagania, gdy średnie stężenie endotoksyn w roztworze A, po uwzględnieniu rozcieńczenia, jest mniejsze niż limit dla produktu.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Oznaczeń metod literami w tekście europejskim i treści jego części niezharmonizowanej (metoda G z rekombinowanym czynnikiem C, rozdziały 5.1.10 i 5.1.13) — nie mieliśmy tekstu Ph. Eur. Wartości K dla poszczególnych dróg podania i limitów endotoksyn dla konkretnych produktów, w tym wody do wstrzykiwań — podają je monografie i wytyczne farmakopei, których tekstu nie mieliśmy.

Zasada metody

Endotoksyny bakterii Gram-ujemnych aktywują lizat amebocytów skrzypłocza. W technice żelowej lizat krzepnie, w turbidymetrycznej narasta zmętnienie po rozszczepieniu substratu endogennego, a w chromogennej powstaje barwa po rozszczepieniu syntetycznego kompleksu peptyd–chromogen. Wynik porównuje się z deklarowaną czułością lizatu albo z krzywą wzorcową wzorca endotoksyny kalibrowanego względem wzorca międzynarodowego WHO; w razie sporu rozstrzyga żelowy test graniczny.

Zastosowania

• Wykrywanie albo oznaczanie ilościowe endotoksyn bakterii Gram-ujemnych w produktach leczniczych (wstęp rozdziału)
• Leki do podawania pozajelitowego — limit endotoksyn K/M ustalany na podstawie dawki i podawany w monografii szczegółowej (rozdz. 6)
• Dobór rozcieńczenia próbki do maksymalnego rozcieńczenia (MVD) i badanie czynników zakłócających przed testem (rozdz. 6–8)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

European Pharmacopoeia 2.6.14

Tytuł (PL)

Endotoksyny bakteryjne

Title (EN)

Bacterial endotoxins

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie sprzętu

   Depirogenizuj szkło zwalidowanym procesem (powszechnie co najmniej 30 min w 250 °C); sprzęt z tworzyw stosuj tylko wolny od wykrywalnych endotoksyn (rozdz. 1).

2. Roztwór próbki i MVD

   Rozpuść albo rozcieńcz próbkę wodą do badania; w razie potrzeby skoryguj pH, aby mieszanina z lizatem miała pH zalecane przez producenta (zwykle 6,0–8,0); oblicz MVD = limit × stężenie roztworu próbki / λ (rozdz. 5, 6).

3. Potwierdzenie czułości lizatu

   Przy nowej serii lizatu i zmianie warunków zbadaj w czterech powtórzeniach roztwory 2λ, λ, 0,5λ i 0,25λ; średnia geometryczna punktów końcowych ma mieścić się w 0,5λ–2λ (rozdz. 7).

4. Czynniki zakłócające

   Zbadaj roztwory A–D (tablica 1 albo 4) na próbce rozcieńczonej nie więcej niż do MVD; zakłócenia usuń większym rozcieńczeniem, czulszym lizatem albo obróbką i sprawdź, że obróbka nie powoduje utraty endotoksyn (rozdz. 7, 8).

5. Test

   Technika żelowa: równe objętości lizatu i roztworu, zwykle 60 ± 2 min w 37 ± 1 °C, potem odwrócenie probówki o około 180°. Techniki fotometryczne: według instrukcji lizatu, z krzywą wzorcową o |r| ≥ 0,980 i odzyskiem 50–200 % (rozdz. 7, 8).

6. Ocena

   Test graniczny: oba powtórzenia roztworu A ujemne — próbka spełnia wymagania; oba dodatnie — nie spełnia; rozbieżne — powtórz test. Techniki ilościowe: średnie stężenie w roztworze A po uwzględnieniu rozcieńczenia ma być mniejsze niż limit dla produktu (rozdz. 7, 8).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Test prowadzi się tak, aby uniknąć zanieczyszczenia endotoksynami (wstęp rozdziału)
• W dostępnym tekście rozdziału nie ma wymagań BHP — zasady bezpiecznej pracy z odczynnikami i próbkami ustala laboratorium

Najczęstsze pytania