🦠 E. coli β-glukuronidazo-dodatnie w żywności

Mikrobiologia PN-ISO 16649-2

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-ISO 16649-2:2004 — wersja polska, opublikowana 22.03.2004, wprowadza ISO 16649-2:2001 [IDT]; karta PKN nie ma adnotacji o wycofaniu ani pola „Zastąpiona przez”. ISO 16649-2:2001 (wydanie pierwsze, 03.05.2001) jest aktualne, bez zmian i poprawek. Ten sam przedmiot obejmują ISO 16649-1 (metoda z membranami, zalecana dla żywności, która może zawierać silnie uszkodzone komórki) i ISO 16649-3 (metoda najbardziej prawdopodobnej liczby).

ZAKRES (rozdz. 1, p. 3.1). Oznaczanie liczby β-glukuronidazo-dodatnich Escherichia coli w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi lub do żywienia zwierząt, metodą liczenia kolonii w 44 °C na podłożu stałym z chromogennym składnikiem do wykrywania enzymu β-glukuronidazy. Za β-glukuronidazo-dodatnie E. coli uznaje się bakterie, które w 44 °C tworzą typowe niebieskie kolonie na podłożu TBX. Ostrzeżenie normy: szczepy E. coli, które nie rosną w 44 °C, a zwłaszcza szczepy β-glukuronidazoujemne, takie jak E. coli O157, nie zostaną wykryte — wykrywanie E. coli wytwarzających toksynę Shiga opisuje ISO/TS 13136 (osobny wpis Bazy wiedzy).

PODŁOŻE TBX (p. 5.2). Na 1 000 ml wody: enzymatyczny hydrolizat kazeiny 20,0 g, sole żółciowe nr 3 1,5 g, kwas 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-glukuronowy (BCIG) 144 µmol (np. 0,075 g soli cykloheksyloamoniowej), dimetylosulfotlenek (DMSO) 3 ml, agar 9–18 g; pH po sterylizacji 7,2 ± 0,2 w 25 °C. BCIG rozpuszcza się w DMSO albo w rozpuszczalniku zalecanym przez producenta, podłoże sterylizuje 15 min w 121 °C i od razu schładza w łaźni wodnej do 44–47 °C. Karta podłoża TBX wytwarzanego zgodnie z normą podaje, że sole żółciowe hamują bakterie Gram-dodatnie, a β-glukuronidaza E. coli uwalnia z substratu chromofor barwiący kolonie; β-glukuronidazę ma 97 % szczepów E. coli, a niektóre gatunki Salmonella również są β-glukuronidazododatnie. Do badania podłoża karta podaje m.in. szczep E. coli ATCC 25922 (WDCM 00013), dający kolonie niebieskie.

LICZENIE I WYNIK (p. 9.3, 10.2, 10.3). Po inkubacji liczy się typowe niebieskie kolonie na każdej płytce, która ma mniej niż 150 kolonii typowych i mniej niż 300 kolonii ogółem (typowych i nietypowych). Wynik jest ważny, gdy co najmniej jedna płytka z dwóch kolejnych rozcieńczeń ma co najmniej 15 niebieskich kolonii; liczbę N w 1 ml albo 1 g oblicza się jako średnią ważoną N = Σa / [V × (n₁ + 0,1·n₂) × d] i zaokrągla do dwóch cyfr znaczących. Gdy obie płytki najniższego rozcieńczenia mają mniej niż 15 niebieskich kolonii, podaje się liczbę szacunkową NE = Σc / (V × n × d), a gdy nie ma na nich żadnej niebieskiej kolonii — wynik „mniej niż 1/d”.

PRZEPISY. W rozporządzeniu Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026) metodą referencyjną kryteriów higieny procesu dla E. coli jest „ISO 16649-1 lub 2” (n = 5, c = 2): mięso mielone i mięso oddzielone mechanicznie — m = 50, M = 500 jtk/g (pkt 2.1.6–2.1.7), surowe wyroby mięsne — 500 i 5 000 jtk/g lub cm² (pkt 2.1.8), sery z mleka lub serwatki poddanych obróbce termicznej — 100 i 1 000 jtk/g (pkt 2.2.2), masło i śmietana z mleka surowego lub poddanego obróbce w temperaturze niższej niż pasteryzacja — 10 i 100 jtk/g (pkt 2.2.6), owoce i warzywa krojone oraz niepasteryzowane soki owocowe i warzywne gotowe do spożycia — 100 i 1 000 jtk/g (pkt 2.5.1–2.5.2). W kryteriach dla mięsa E. coli jest wskaźnikiem zanieczyszczenia bakteriami typu kałowego, a dla serów, masła i śmietany — wskaźnikiem poziomu higieny. Dla żywych małży (pkt 1.25) i produktów z gotowanych skorupiaków i mięczaków (pkt 2.4.1) rozporządzenie wskazuje metodę najbardziej prawdopodobnej liczby (ISO 16649-3), a dla wody do spożycia metodami referencyjnymi są PN-EN ISO 9308-1 i PN-EN ISO 9308-2 (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 4 cz. A). Według rozdziału 4 podręcznika BAM (FDA) E. coli wskazuje na świeże zanieczyszczenie kałowe albo niehigieniczne przetwarzanie.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się na p. 10.3.3; dalszej części rozdz. 10 i sprawozdania z badań (rozdz. 11) w nim nie ma. Przygotowania próbki, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń norma nie opisuje — odsyła do ISO 6887-1 i norm dla danego produktu, a praktykę laboratoryjną — do ISO 7218. Badania przydatności podłoża, szczepów kontrolnych i niepewności wyniku dostępny tekst nie obejmuje.

Zasada metody

Dwie płytki na rozcieńczenie zalewa się podłożem TBX z próbką ciekłą albo zawiesiną wyjściową i kolejnymi rozcieńczeniami dziesiętnymi, inkubuje 18–24 h w (44 ± 1) °C i liczy kolonie, które ze względu na wygląd uznaje się za β-glukuronidazo-dodatnie E. coli (p. 4.1). Bakterie z β-glukuronidazą rozkładają chromogenny substrat BCIG zawarty w podłożu i tworzą niebieskie kolonie (p. 3.1, 5.2); sole żółciowe hamują bakterie Gram-dodatnie (karta podłoża TBX wytwarzanego zgodnie z normą). Liczbę jtk w 1 g albo 1 ml próbki oblicza się według rozdz. 10 (p. 4.2).

Zastosowania

• Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1)
• Mięso mielone, mięso oddzielone mechanicznie i surowe wyroby mięsne — kryteria higieny procesu z metodą „ISO 16649-1 lub 2” (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.1.6–2.1.8)
• Sery z mleka lub serwatki poddanych obróbce termicznej oraz masło i śmietana z mleka surowego lub poddanego obróbce w temperaturze niższej niż pasteryzacja (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.2.2 i 2.2.6)
• Owoce i warzywa krojone oraz niepasteryzowane soki owocowe i warzywne gotowe do spożycia (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.5.1–2.5.2)
• Badania w ramach potwierdzania lub weryfikacji procedur opartych na zasadach HACCP i dobrej praktyki higienicznej (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, art. 4)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 16649-2:2004

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby β-glukuronidazo-dodatnich Escherichia coli — Część 2: Metoda płytkowa w temperaturze 44 °C z zastosowaniem 5-bromo-4-chloro-3-indolilo β-D-glukuronidu

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide

Procedura krok po kroku

1. Próbka i zawiesina wyjściowa

   Próbkę do badań, zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia dziesiętne przygotowuje się według ISO 6887-1 i normy dla danego produktu (rozdz. 8, p. 9.1). Pobieranie próbek nie jest częścią metody (rozdz. 7).

2. Posiew

   Do jałowej płytki Petriego przenieść 1 ml próbki ciekłej albo 1 ml zawiesiny wyjściowej (10⁻¹), dwie płytki na rozcieńczenie; w razie potrzeby powtórzyć z kolejnymi rozcieńczeniami, każdorazowo nową jałową pipetą (p. 9.2.1).

3. Zalanie podłożem

   Wlać na każdą płytkę około 15 ml podłoża TBX schłodzonego w łaźni do 44–47 °C, starannie wymieszać z inokulum i zostawić do zestalenia na chłodnej, poziomej powierzchni. Od rozdzielenia inokulum do wlania podłoża nie może upłynąć więcej niż 15 min (p. 9.2.2).

   🌡 Temperatura: 44–47 °C

4. Inkubacja

   Płytki odwrócić dnem do góry i inkubować w 44 °C przez 18–24 h; łączny czas inkubacji nie może przekroczyć 24 h (p. 9.2.3).

   🌡 Temperatura: 44 ± 1 °C

5. Komórki uszkodzone

   Gdy podejrzewa się obecność komórek uszkodzonych, płytki inkubować najpierw 4 h w 37 °C, potem 18–24 h w 44 °C; temperatura inkubacji nie może przekroczyć 45 °C (ostrzeżenie w p. 9.2.3).

   🌡 Temperatura: 37 °C → 44 °C

6. Liczenie kolonii

   Policzyć typowe niebieskie kolonie na każdej płytce, która ma mniej niż 150 kolonii typowych i mniej niż 300 kolonii ogółem; płytki z 0 kolonii typowych uwzględnia się w obliczeniach, jeśli należą do płytek zachowanych (p. 9.3).

7. Obliczenie

   N = Σa / [V × (n₁ + 0,1·n₂) × d] — z dwóch kolejnych rozcieńczeń, gdy co najmniej jedna płytka ma co najmniej 15 niebieskich kolonii; wynik zaokrąglić do dwóch cyfr znaczących i podać w jtk/ml albo jtk/g (p. 10.2).

8. Małe liczby

   Gdy obie płytki najniższego rozcieńczenia mają mniej niż 15 niebieskich kolonii — liczba szacunkowa NE = Σc / (V × n × d); gdy nie ma niebieskiej kolonii — „mniej niż 1/d” w 1 ml albo 1 g; przypadek z ponad 300 koloniami przy pierwszym rozcieńczeniu i bez niebieskich kolonii przy kolejnym — według p. 10.3.3.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Dimetylosulfotlenek jest szkodliwy przy wdychaniu i kontakcie ze skórą — zaleca się pracę pod wyciągiem; ze względu na tę toksyczność można użyć rozpuszczalnika zalecanego przez producenta (p. 5.2.1, przypis b)
• Praktykę laboratoryjną norma odsyła do ISO 7218 (rozdz. 5 i 6)

Najczęstsze pytania