🦠 E. coli i bakterie grupy coli w wodzie

Mikrobiologia PN-EN ISO 9308-1

Przegląd

STATUS (stan na 29.10.2026). PN-EN ISO 9308-1:2014-12 — wersja polska, opublikowana 14.10.2015, wprowadza EN ISO 9308-1:2014 [IDT] i ISO 9308-1:2014 [IDT]; zastąpiła PN-EN ISO 9308-1:2004 z poprawkami Ap1:2005 i AC:2009. Zmiana PN-EN ISO 9308-1:2014-12/A1:2017-04 — tylko wersja angielska, opublikowana 04.04.2017, wprowadza EN ISO 9308-1:2014/A1:2017 [IDT] i ISO 9308-1:2014/Amd 1:2016 [IDT]. Obie bez adnotacji o wycofaniu. ISO 9308-1:2014 (wydanie trzecie) zastąpiło wydanie z 2000 r. po rewizji technicznej i objęło jego poprawkę Cor.1:2007.

ZMIANA A1 (ISO 9308-1:2014/Amd 1:2016, cały tekst zmiany — jedna strona). Zmienia czas inkubacji w rozdz. 4 i p. 8.3 z (21 ± 3) h na 21–24 h w (36 ± 2) °C oraz zastępuje tablicę 1 badania przydatności podłoża CCA (p. 11.2): wydajność — Escherichia coli WDCM 00013 albo WDCM 00012 (kolonie ciemnoniebieskie do fioletowych) oraz Enterobacter aerogenes WDCM 00175 albo Citrobacter freundii WDCM 00006 (kolonie różowe do czerwonych), ilościowo wobec agaru TSA, kryterium PR ≥ 0,7; selektywność — Enterococcus faecalis WDCM 00087 albo WDCM 00009 (całkowite albo częściowe zahamowanie wzrostu); specyficzność — Pseudomonas aeruginosa WDCM 00024 (kolonie bezbarwne). Czasy w tym opisie podajemy według zmiany.

ZAKRES (rozdz. 1). Liczenie E. coli i bakterii grupy coli: filtracja membranowa, hodowla na chromogennym podłożu dla bakterii grupy coli (CCA) i obliczenie liczby organizmów w próbce. Podłoże jest mało selektywne, więc wzrost flory towarzyszącej przeszkadza w wiarygodnym liczeniu — metoda nie nadaje się do wód powierzchniowych ani wody z płytkich studni. Jest przeznaczona dla wód z małą liczbą bakterii, które dadzą na CCA mniej niż 100 kolonii ogółem: wody do picia, dezynfekowanej wody basenowej i wody uzdatnionej w stacjach uzdatniania. Szczepy E. coli bez β-D-glukuronidazy, takie jak E. coli O157, nie zostaną wykryte jako E. coli — jako β-D-galaktozydazododatnie wyrosną na tym podłożu jak bakterie grupy coli.

DEFINICJE I ZNACZENIE (rozdz. 3, wprowadzenie). Bakterie grupy coli to Enterobacteriaceae wytwarzające β-D-galaktozydazę, a E. coli — Enterobacteriaceae wytwarzające β-D-galaktozydazę i β-D-glukuronidazę. E. coli bytuje zwykle w jelicie człowieka i zwierząt stałocieplnych, więc wskazuje na zanieczyszczenie kałowe. Część bakterii grupy coli żyje w glebie i wodach powierzchniowych — ich obecność nie dowodzi zanieczyszczenia kałowego, ale może wskazywać na niesprawność uzdatniania, magazynowania albo dystrybucji.

PODŁOŻE CCA (zał. B — skład według specyfikacji ISO 9308-1:2014 przytoczonej w karcie podłoża wytwarzanego zgodnie z normą). Na 1 l: enzymatyczny hydrolizat kazeiny 1,0 g, ekstrakt drożdżowy 2,0 g, chlorek sodu 5,0 g, diwodorofosforan sodu dihydrat 2,2 g, wodorofosforan disodu 2,7 g, pirogronian sodu 1,0 g, sorbitol 1,0 g, tryptofan 1,0 g, Tergitol-7 0,15 g, 6-chloro-3-indoksylo-β-D-galaktopiranozyd 0,2 g, kwas 5-bromo-4-chloro-3-indoksylo-β-D-glukuronowy (sól cykloheksyloamoniowa, monohydrat) 0,1 g, IPTG 0,1 g, agar 9–18 g; pH 6,8 ± 0,2. Norma dopuszcza podłoża i odczynniki handlowe o składzie z załącznika B, przygotowane ściśle według instrukcji producenta (rozdz. 6).

PRZEPISY. Woda do spożycia: E. coli 0 w 100 ml (w wodzie rozlewanej do butelek lub pojemników — w 250 ml) (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. A tab. 1) — razem z enterokokami jelitowymi to „parametry podstawowe”, których częstotliwości monitorowania nie zmniejsza się (zał. nr 3 cz. I). Bakterie grupy coli: 0 w 100 ml; dopuszcza się pojedyncze, poniżej 10 jtk lub NPL w 100 ml, przy jednoczesnym wykluczeniu E. coli i enterokoków jelitowych — wtedy bada się E. coli i enterokoki (zał. nr 1 cz. C tab. 1, objaśnienie 1). Metodą referencyjną dla obu parametrów jest PN-EN ISO 9308-1 albo PN-EN ISO 9308-2 (zał. nr 4 cz. A). Pływalnie: E. coli 0 w 100 ml w wodzie wprowadzanej do niecki i w niecce (Dz.U. 2022 poz. 1230, zał. nr 1).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się w p. 8.3 (na opisie potwierdzania testem oksydazy). Wyrażanie wyników (rozdz. 9), sprawozdanie (rozdz. 10), zapewnienie jakości poza tablicą 1 (rozdz. 11), przepis na odczynnik oksydazowy (zał. B.2) i charakterystyki metody (zał. C) są poza nim.

Zasada metody

Porcję próbki przesącza się przez sączek membranowy, który zatrzymuje bakterie, i układa sączek na płytce z chromogennym podłożem dla bakterii grupy coli (CCA). Po inkubacji w (36 ± 2) °C przez 21–24 h kolonie z dodatnią reakcją β-D-galaktozydazy (różowe do czerwonych) liczy się jako domniemane bakterie grupy coli inne niż E. coli — aby wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie od bakterii oksydazododatnich, takich jak Aeromonas, potwierdza się je ujemną reakcją oksydazy. Kolonie z dodatnią reakcją β-D-galaktozydazy i β-D-glukuronidazy (ciemnoniebieskie do fioletowych) liczy się jako E. coli. Bakterie grupy coli ogółem to suma oksydazoujemnych kolonii różowych do czerwonych i wszystkich kolonii ciemnoniebieskich do fioletowych (rozdz. 4 w brzmieniu zmiany A1).

Zastosowania

• Woda do picia, dezynfekowana woda basenowa i woda uzdatniona w stacjach uzdatniania (rozdz. 1)
• Woda do spożycia — E. coli 0 w 100 ml (woda rozlewana do butelek lub pojemników — w 250 ml); bakterie grupy coli 0 w 100 ml (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1)
• Metoda referencyjna dla E. coli i bakterii grupy coli w wodzie do spożycia, obok PN-EN ISO 9308-2 (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 4 cz. A)
• Pływalnie — E. coli 0 w 100 ml w wodzie wprowadzanej do niecki i w niecce (Dz.U. 2022 poz. 1230, zał. nr 1)
• Woda butelkowana — z filtracją 250 ml (p. 8.2)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 9308-1:2014-12 (wersja polska) wraz ze ZMIANĄ A1:2017-04 (wersja angielska)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 1: Metoda filtracji membranowej do badania wód o małej ilości mikroflory towarzyszącej

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora

Procedura krok po kroku

1. Pobranie i przechowanie próbki

   Próbki pobiera się i dostarcza według ISO 19458; transport i przechowywanie w (5 ± 3) °C. Wyjątkowo próbkę można przechowywać w (5 ± 3) °C do 24 h przed badaniem — czas przechowania podaje się w sprawozdaniu (rozdz. 7, p. 8.1).

2. Filtracja

   Przygotowanie próbki, filtrację i posiew prowadzi się według ISO 8199. Przesączyć 100 ml próbki (albo inną objętość, np. 250 ml wody butelkowanej) przez sączek membranowy; najmniejsza objętość to 10 ml próbki albo jej rozcieńczenia — zapewnia równomierne rozłożenie bakterii na sączku (p. 8.1–8.2).

3. Przeniesienie na podłoże

   Sączek ułożyć na podłożu CCA tak, by nie zostało pod nim powietrze; płytkę odwrócić (p. 8.3).

4. Inkubacja

   Inkubować w (36 ± 2) °C przez 21–24 h (p. 8.3 w brzmieniu zmiany A1).

   🌡 Temperatura: 36 ± 2 °C

5. Liczenie kolonii

   Kolonie różowe do czerwonych (β-D-galaktozydaza) liczyć jako domniemane bakterie grupy coli inne niż E. coli; kolonie ciemnoniebieskie do fioletowych (β-D-galaktozydaza i β-D-glukuronidaza) — jako E. coli (p. 8.3).

6. Test oksydazy

   Zbadać wszystkie albo co najmniej 10 kolonii różowych do czerwonych, wybranych według ISO 8199 — testem handlowym albo nanosząc 2–3 krople świeżego odczynnika oksydazowego na bibułę w płytce Petriego i przenosząc na nią kolonię ezą plastikową albo platynową. Ciemnoniebieska barwa w ciągu 30 s oznacza reakcję dodatnią — bakterie grupy coli są oksydazoujemne. Przy gęstym wzroście albo kolonii przylegającej do innych najpierw wykonać subkulturę, aby test dotyczył czystej hodowli (p. 8.3).

7. Wynik

   E. coli — kolonie ciemnoniebieskie do fioletowych; bakterie grupy coli ogółem — oksydazoujemne kolonie różowe do czerwonych i wszystkie kolonie ciemnoniebieskie do fioletowych (rozdz. 4). Przeliczenie na objętość próbki — rozdz. 9, poza dostępnym tekstem normy.

8. Kontrola podłoża

   Przydatność CCA bada się szczepami wzorcowymi z tablicy 1 w brzmieniu zmiany A1 (wydajność, selektywność, specyficzność; inkubacja (36 ± 2) °C, 21–24 h); każdą partię sączków sprawdza się według ISO 7704 (p. 5.5, 11.2).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Osoby korzystające z normy powinny znać zwykłą praktykę laboratoryjną; norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP i zgodności z przepisami krajowymi należy do użytkownika (ostrzeżenie normy)
• Badania według normy muszą wykonywać odpowiednio wykwalifikowani pracownicy (ostrzeżenie normy)

Najczęstsze pytania