🌿 Test toksyczności ostrej — Daphnia magna

Środowisko PN-EN ISO 6341

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 6341:2013-04 — wersja angielska (tytuł polski w katalogu PKN: „Jakość wody — Oznaczanie hamowania mobilności Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Test toksyczności ostrej”), opublikowana 17.04.2013, wprowadza EN ISO 6341:2012 i ISO 6341:2012 [IDT]; zastąpiła PN-EN ISO 6341:2002 (wersję polską). Karta nie ma adnotacji o wycofaniu — norma aktualna; w katalogu ISO norma potwierdzona (etap 90.93). ISO 6341:2012 to wydanie czwarte z 15.10.2012 r., które zastąpiło ISO 6341:1996 i włączyło jej poprawkę techniczną Cor 1:1998.

ZAKRES (rozdz. 1). Oznaczanie ostrej toksyczności dla Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — substancji chemicznych rozpuszczalnych w warunkach badania albo tworzących w nich stabilną zawiesinę lub dyspersję, ścieków przemysłowych i komunalnych, oczyszczonych i nieoczyszczonych, wyciągów wodnych i odcieków, wód słodkich powierzchniowych i podziemnych oraz eluatów i wody porowej osadów słodkowodnych. Skorupiaki są ważne ekotoksykologicznie jako konsumenci pierwotni i główny składnik zooplanktonu (wprowadzenie).

ZASADA I DEFINICJE (rozdz. 3–4). Unieruchomiony jest osobnik, który nie pływa przez 15 s po łagodnym poruszeniu roztworu, nawet jeśli porusza czułkami; neonat to osobnik pierwszego stadium w wieku poniżej 24 h. Wyznacza się początkowe stężenie, które w ciągu 24 h albo 48 h unieruchamia 50 % rozwielitek — 24 h EC50 albo 48 h EC50; pożądane są też najniższe stężenie unieruchamiające wszystkie i najwyższe nieunieruchamiające żadnej. Badanie ma jeden albo dwa etapy: wstępny, wyznaczający zakres stężeń, i ostateczny; dla substancji można wykonać badanie graniczne przy 100 mg/l albo niższym stężeniu rozpuszczalności.

WARUNKI I ORGANIZMY (rozdz. 5–6). Ekspozycja w ciemności albo przy fotoperiodzie 16 h światła i 8 h ciemności, w (20 ± 2) °C, w atmosferze bez toksycznych par i pyłów. Neonaty w wieku poniżej 24 h, najlepiej nie z pierwszego miotu, ze zdrowej hodowli — bez śmiertelności powyżej 20 % w 2 dni, samców, efippiów i odbarwionych zwierząt; mogą też pochodzić z jaj przetrwalnikowych (efippiów) albo od wyspecjalizowanego dostawcy. Woda czysta — przewodność poniżej 10 µS/cm. Do hodowli i rozcieńczeń nadaje się woda naturalna, rekonstytuowana albo odchlorowana wodociągowa, jeśli rozwielitki żyją w niej bez objawów stresu; zalecane pH 6–9 i twardość 140–275 mg/l CaCO₃. Przykładowa woda rekonstytuowana ma pH 7,8 ± 0,5, twardość (225 ± 50) mg/l CaCO₃, stosunek molowy Ca : Mg bliski 4 : 1 i tlen powyżej 7 mg/l: po 25 ml roztworów chlorku wapnia dwuwodnego (11,76 g/l), siarczanu magnezu siedmiowodnego (4,93 g/l), wodorowęglanu sodu (2,59 g/l) i chlorku potasu (0,23 g/l) uzupełnia się do 1 l, napowietrza do nasycenia i ustabilizowania pH, a potem już nie napowietrza. Pożywka M4 (załącznik A) służy do hodowli — nie stosuje się jej jako wody do rozcieńczeń próbek z metalami dwuwartościowymi ani próbek o nieznanym składzie, bo EDTA zmniejsza biodostępność metali.

PRÓBKI I ROZCIEŃCZENIA (rozdz. 8). Badanie jak najszybciej, najlepiej w ciągu 12 h od pobrania; inaczej próbkę schładza się do 0–5 °C i bada w ciągu 24 h, a gdy badanie w ciągu 72 h jest niemożliwe — zamraża poniżej −18 °C i bada w ciągu 2 miesięcy (rozmrażanie najwyżej w 30 °C, nie w mikrofalówce). Zawiesinę można odstawić najwyżej na 2 h, odwirować (np. 10 min przy 5 000 g) albo przesączyć; napowietrza się tylko przy tlenie poniżej 40 % nasycenia, najwyżej 20 min. Badanie wykonuje się bez korekty pH; pH mierzy się na początku i na końcu, a przy działaniu toksycznym w pH poza 6,0–9,0 można je powtórzyć z korektą. Co najmniej pięć stężeń w szeregu geometrycznym: dla ścieków, wód, wody porowej i wyciągów zwykle ze współczynnikiem 2, dla substancji w badaniu ostatecznym — najwyżej 3,2 (przy stromej krzywej 2,2); każde stężenie i kontrola najlepiej w czterech powtórzeniach; rozpuszczalnik najwyżej 0,1 ml/l, z kontrolą bez rozpuszczalnika i z rozpuszczalnikiem.

PRZEBIEG — DRUGIE ŹRÓDŁO. Metoda C.2 rozporządzenia (WE) nr 440/2008 (badanie nagłego unieruchomienia Daphnia sp., zgodne z wytyczną OECD 202 z 2004 r.): co najmniej 20 zwierząt na stężenie i kontrolę w czterech grupach po pięć, co najmniej 2 ml roztworu na zwierzę; 18–22 °C bez zmian o więcej niż ± 1 °C w badaniu; bez napowietrzania, bez korekty pH i bez karmienia; odczyt po 24 h i 48 h; tlen i pH na początku i na końcu w kontroli i w najwyższym stężeniu. Badanie jest ważne, gdy w kontrolach unieruchomiono najwyżej 10 % rozwielitek, a tlen na końcu przekracza 3 mg/l; substancję odniesienia bada się co miesiąc, co najmniej dwa razy w roku.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Z ISO 6341:2012 dostępny jest tekst do p. 9.1; badanie wstępne i ostateczne, sprawdzenie wrażliwości dichromianem potasu (9.4) z wymaganym zakresem 24 h EC50, badanie graniczne, sposób wyznaczania EC50 i kryteria ważności (rozdz. 10), sprawozdanie i dane precyzji (załącznik E) są poza nim — dlatego nie podajemy zakresu EC50 dichromianu ani kryteriów ważności z normy (w drugim źródle są kryteria metody C.2).

Zasada metody

Młode osobniki Daphnia magna w wieku poniżej 24 godzin poddaje się w temperaturze (20 ± 2) °C, w ciemności albo przy fotoperiodzie 16 h + 8 h, działaniu szeregu stężeń próbki albo substancji przygotowanych w wodzie do rozcieńczeń; po 24 h albo 48 h liczy się osobniki niezdolne do pływania przez 15 s po łagodnym poruszeniu.

Z odsetka unieruchomionych wyznacza się 24 h EC50 albo 48 h EC50 — początkowe stężenie, które unieruchamia połowę zwierząt (rozdz. 3–5).

Zastosowania

• Substancje chemiczne rozpuszczalne albo tworzące stabilną zawiesinę lub dyspersję w warunkach badania (rozdz. 1)
• Ścieki przemysłowe i komunalne, oczyszczone i nieoczyszczone (rozdz. 1)
• Wyciągi wodne i odcieki (rozdz. 1)
• Wody słodkie powierzchniowe i podziemne; eluaty i woda porowa osadów słodkowodnych (rozdz. 1)
• Ostra toksyczność substancji dla rozwielitek — metoda C.2 rozporządzenia (WE) nr 440/2008, zgodna z wytyczną OECD 202

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 6341:2013-04

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie hamowania mobilności Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Test toksyczności ostrej

Title (EN)

Water quality — Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Acute toxicity test

Procedura krok po kroku

1. Hodowla i neonaty

   Zdrowa hodowla — bez śmiertelności powyżej 20 % w 2 dni, samców, efippiów i odbarwienia; samice z jajami izoluje się, a młode zbiera w ciągu 24 h; przy innych warunkach hodowli — aklimatyzacja jednego pokolenia przez około tydzień (6.1).

2. Próbka

   Badanie najlepiej w ciągu 12 h od pobrania (w 0–5 °C — w ciągu 24 h; zamrożona poniżej −18 °C — w ciągu 2 miesięcy); homogenizacja ręczna; zawiesina — odstanie najwyżej 2 h, wirowanie albo sączenie; pomiar pH i tlenu; bez korekty pH (8.1).

3. Szereg stężeń

   Co najmniej pięć stężeń w szeregu geometrycznym w wodzie do rozcieńczeń — dla ścieków i wód zwykle ze współczynnikiem 2; każde stężenie i kontrola najlepiej w czterech powtórzeniach (8.2.2, 9.1).

4. Ekspozycja

   Co najmniej 20 zwierząt na stężenie i kontrolę, w grupach po pięć, co najmniej 2 ml roztworu na zwierzę; (20 ± 2) °C, ciemność albo 16 h + 8 h; bez karmienia i napowietrzania (rozdz. 5; metoda C.2, 1.8.1).

5. Odczyt

   Po 24 h i 48 h liczba unieruchomionych — niezdolnych do pływania przez 15 s po łagodnym poruszeniu, nawet jeśli poruszają czułkami; tlen rozpuszczony i pH na początku i na końcu badania w kontroli i w najwyższym stężeniu (3.3, 8.1; metoda C.2, 1.8.2–1.8.3).

6. Wynik i ważność

   EC50 z odsetka unieruchomionych w funkcji stężenia (np. analiza probitowa) z przedziałem ufności 95 %; badanie ważne, gdy w kontrolach unieruchomiono najwyżej 10 % zwierząt, a tlen na końcu przekracza 3 mg/l (metoda C.2, 1.6 i 2).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Norma zastrzega, że badanie wymaga znajomości zwykłej praktyki laboratoryjnej i odpowiednio wykwalifikowanego personelu, a zasady BHP ustala użytkownik (ostrzeżenie normy)
• Dichromian potasu jest substancją rakotwórczą, toksyczną przy wdychaniu — gotowy roztwór o określonym stężeniu zmniejsza ryzyko wdychania pyłu (6.4)

Najczęstsze pytania