🔴 Cronobacter spp. w żywności i paszach

Mikrobiologia PN-EN ISO 22964

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 22964:2017-06 — wersja angielska opublikowana 13.06.2017, wersja polska 15.11.2019; wprowadza EN ISO 22964:2017 i ISO 22964:2017 [IDT], bez adnotacji o wycofaniu. ISO 22964:2017 (wydanie pierwsze, 04.04.2017) jest aktualne i zastąpiło ISO/TS 22964:2006 — zmiany uznano za duże (ISO 17468): zakres rozszerzono na żywność, pasze i próbki środowiskowe, bulion mLST zastąpiono bulionem selektywnym CSB, agar ESIA — chromogennym agarem CCI, a część testów potwierdzających — testami z tablicy 1.

ZAKRES (rozdz. 1, p. 3.1). Wykrywanie Cronobacter spp. w produktach i składnikach żywności przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt oraz w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością. Cronobacter spp. to drobnoustroje tworzące typowe kolonie na chromogennym agarze CCI i mające cechy biochemiczne opisane w normie; mogą występować w małej liczbie obok innych Enterobacteriaceae, np. E. cloacae, które utrudniają ich wykrycie (uwaga w p. 5.1). Według rozdziału 29 podręcznika BAM (FDA) źródło zakażeń nie jest znane, ale coraz więcej doniesień wskazuje jako ich nośnik preparaty w proszku dla niemowląt; odsetek zgonów był w opisanych zakażeniach bardzo różny, w niektórych sięgał 80 %.

PORCJA BADANA I NAMNAŻANIE (p. 10.1–10.3). Zwykle 10 g albo 10 ml próbki na 90 ml zbuforowanej wody peptonowej ogrzanej do temperatury pokojowej; dla mleka w proszku — według ISO 6887-5. Normę zwalidowano dla porcji 10 g: mniejszą można badać w tej samej proporcji bez walidacji, większą — po walidacji albo weryfikacji (duże porcje mogą utrudnić odzysk komórek uszkodzonych, gdy jest flora przeszkadzająca, np. probiotyki); przy porcjach większych niż 10 g wodę peptonową ogrzewa się wcześniej do 34–38 °C. Namnażanie wstępne — (18 ± 2) h w 34–38 °C; potem 0,1 ml hodowli do 10 ml bulionu CSB i (24 ± 2) h w (41,5 ± 1) °C.

IZOLACJA I POTWIERDZENIE (p. 10.4–10.6). Z bulionu CSB posiewa się ezą 10 µl agar CCI i inkubuje (24 ± 2) h w 41,5 °C. Kolonie typowe Cronobacter są małe do średnich (1–3 mm), niebieskie do niebieskozielonych; inne bywają białe albo białe z zielonym środkiem, szare lub czarne, a niektóre naturalnie barwne — żółte lub czerwone. Pięć kolonii typowych lub podejrzanych (gdy mniej — wszystkie) oczyszcza się na agarze TSA ((21 ± 3) h w 34–38 °C) i bada: oksydaza, hydroliza 4-nitrofenylo-α-D-glukopiranozydu, dekarboksylaza L-lizyny i L-ornityny, kwas z D-arabitolu, D-sorbitolu i sacharozy, opcjonalnie czerwień metylowa, reakcja Voges-Proskauera i kwas z α-metylo-D-glukozydu. Cronobacter spp. są oksydazoujemne, hydrolizują 4-nitrofenylo-α-D-glukopiranozyd i wytwarzają kwas z sacharozy, nie dekarboksylują L-lizyny i nie wytwarzają kwasu z D-sorbitolu; dodatnia czerwień metylowa i ujemna reakcja Voges-Proskauera zdarzają się rzadko.

PRZEPISY. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026), kryterium bezpieczeństwa żywności 1.24: preparaty w proszku do początkowego żywienia niemowląt i żywność dietetyczna w proszku specjalnego przeznaczenia medycznego przeznaczona dla niemowląt w wieku do 6 miesięcy — Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) nie wykryto w 10 g, n = 30, c = 0, metoda EN ISO 22964, produkty wprowadzane do obrotu w okresie przydatności do spożycia. Badania na Enterobacteriaceae i Cronobacter spp. prowadzi się równolegle, chyba że w danym zakładzie ustalono współzależność między nimi; jeśli w próbce wykryto Enterobacteriaceae, partię bada się na Cronobacter spp. (przypis 14). Przy niezadowalającym wyniku badania kryterium bezpieczeństwa żywności produkt lub partię wycofuje się z obrotu lub od konsumenta zgodnie z art. 19 rozporządzenia (WE) nr 178/2002 (art. 7 ust. 2).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Składu podłoży i odczynników (zał. B) ani cech odróżniających Cronobacter od gatunków pokrewnych (zał. C) nie ma w dostępnym tekście normy — nie podajemy ich.

Zasada metody

Porcję badaną dodaje się do zbuforowanej wody peptonowej i inkubuje w 34–38 °C przez (18 ± 2) h — nieselektywne namnażanie wstępne (p. 5.1). Hodowlą zaszczepia się selektywny bulion CSB i inkubuje w (41,5 ± 1) °C przez (24 ± 2) h (p. 5.2), a następnie posiewa chromogenny agar CCI i inkubuje w (41,5 ± 1) °C przez (24 ± 2) h (p. 5.3). Kolonie typowe oczyszcza się na agarze nieselektywnym, np. TSA, i bada biochemicznie (p. 5.4).

Zastosowania

• Produkty i składniki żywności przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1)
• Próbki środowiskowe z produkcji i obrotu żywnością (rozdz. 1)
• Mleko w proszku — przygotowanie próbki według ISO 6887-5 (p. 10.1)
• Preparaty w proszku do początkowego żywienia niemowląt i żywność dietetyczna w proszku specjalnego przeznaczenia medycznego dla niemowląt do 6 miesięcy — kryterium bezpieczeństwa żywności (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 1.24)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 22964:2017-06

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania Cronobacter spp.

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.

Procedura krok po kroku

1. Porcja badana

   Zwykle 10 g albo 10 ml próbki do 90 ml zbuforowanej wody peptonowej ogrzanej do temperatury pokojowej (przy porcjach powyżej 10 g — do 34–38 °C); mleko w proszku według ISO 6887-5 (p. 10.1).

2. Namnażanie wstępne

   Inkubować w 34–38 °C przez (18 ± 2) h (p. 10.2).

   🌡 Temperatura: 34–38 °C

3. Namnażanie selektywne

   Wymieszać, przenieść 0,1 ml hodowli do 10 ml bulionu CSB, wymieszać i inkubować w 41,5 °C przez (24 ± 2) h (p. 10.3).

   🌡 Temperatura: 41,5 °C

4. Izolacja

   Wymieszać hodowlę i posiać ezą 10 µl agar CCI tak, by uzyskać kolonie izolowane; inkubować w 41,5 °C przez (24 ± 2) h (p. 10.4).

   🌡 Temperatura: 41,5 °C

5. Odczyt

   Kolonie typowe: małe do średnich (1–3 mm), niebieskie do niebieskozielonych; inne bywają białe, białe z zielonym środkiem, szare, czarne, żółte lub czerwone (p. 10.4).

6. Oczyszczenie

   Pięć kolonii typowych lub podejrzanych (gdy mniej — wszystkie) posiać na agar TSA i inkubować płytki odwrócone w 34–38 °C przez (21 ± 3) h; można najpierw zbadać najbardziej charakterystyczną kolonię — wynik dodatni kończy badanie (p. 10.5.1–10.5.2).

   🌡 Temperatura: 34–38 °C

7. Testy biochemiczne

   Oksydaza, hydroliza 4-nitrofenylo-α-D-glukopiranozydu (4 h w 37 °C, absorbancja przy 405 nm co najmniej 0,3), dekarboksylaza L-lizyny i L-ornityny ((24 ± 2) h w 37 °C), kwas z D-arabitolu, D-sorbitolu i sacharozy ((48 ± 2) h w 37 °C), opcjonalnie czerwień metylowa i reakcja Voges-Proskauera; dopuszczalne sprawdzone miniaturowe zestawy testów biochemicznych (p. 10.5.3).

8. Interpretacja i wynik

   Cronobacter spp.: oksydaza ujemna, hydroliza 4-nitrofenylo-α-D-glukopiranozydu i kwas z sacharozy — dodatnie, dekarboksylaza L-lizyny i kwas z D-sorbitolu — ujemne; wynik: wykryto albo nie wykryto w porcji badanej x g albo x ml (p. 10.6, rozdz. 11).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Norma nie zawiera rozdziału o bezpieczeństwie — praktykę laboratoryjną odsyła do ISO 7218 (rozdz. 6)

Najczęstsze pytania