🦠 Clostridium perfringens w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 7937

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 7937:2005 — wersja polska, opublikowana 18.11.2005, wprowadzała EN ISO 7937:2004 i ISO 7937:2004 [IDT]; WYCOFANA 09.05.2024 i zastąpiona przez PN-EN ISO 15213-2:2024-05 (wersja angielska, opublikowana 09.05.2024, wprowadza EN ISO 15213-2:2023 i ISO 15213-2:2023 [IDT]). ISO 7937:2004 wycofano 16.11.2023; ISO 15213-2:2023 (wydanie pierwsze, 16.11.2023) ma tytuł „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Clostridium spp. — Część 2: Oznaczanie liczby Clostridium perfringens metodą liczenia kolonii”. Zmiany uznano za duże (ISO 17468) — wpływają na charakterystyki metody: zakres rozszerzono o próbki z produkcji pierwotnej; obróbka cieplna 10 min w 80 °C jest opcjonalna (przy dużej florze towarzyszącej albo do liczenia samych przetrwalników); podłoże SC przemianowano na TSC bez zmiany składu; potwierdzanie zmieniono według ISO 14189; dodano kryteria badania przydatności podłoży, charakterystyki metody i metody molekularne odróżniające szczepy chorobotwórcze. Opis podaje treść ISO 15213-2:2023.

ZAKRES (ISO 15213-2, rozdz. 1). Liczenie C. perfringens metodą płytkową w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt, w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością i paszami oraz w próbkach z produkcji pierwotnej. Metodę zwalidowano międzylaboratoryjnie dla produktów mięsnych gotowych do spożycia i do odgrzania, jaj i produktów jajecznych, przetworzonych owoców i warzyw, preparatów i kaszek dla niemowląt, potraw wieloskładnikowych, karmy dla zwierząt domowych i pasz oraz próbek środowiskowych; dla produkcji pierwotnej charakterystyk nie wyznaczono. Technika nadaje się do próbek dających co najmniej 10 kolonii na płytce — powyżej 10 jtk/ml w próbkach płynnych albo 100 jtk/g w stałych; przy dwóch płytkach (suma co najmniej 10 kolonii) — powyżej 5 jtk/ml albo 50 jtk/g.

ZNACZENIE (wprowadzenie). C. perfringens to Gram-dodatnia, beztlenowa bakteria przetrwalnikująca, występująca głównie w glebie, ale także w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt — duża liczba w żywności może świadczyć o niewłaściwym przygotowaniu lub obchodzeniu się z nią. Duża liczba w żywności gotowej do spożycia może wywołać chorobę, głównie biegunkę; zatrucia powodują szczepy wytwarzające enterotoksynę CPE, uwalnianą podczas sporulacji w jelicie cienkim. Przetrwalniki są ciepłooporne i mogą kiełkować i namnażać się w żywności gotowej do spożycia po obróbce cieplnej.

KOLONIE I DEFINICJE (p. 3, 4.3, 9.5). Przypuszczalne C. perfringens to bakterie przetrwalnikujące tworzące policzalne typowe kolonie w podłożu selektywnym w warunkach ściśle beztlenowych; potwierdzone — ponadto mające fosfatazę kwaśną; chorobotwórcze dla człowieka — potwierdzone szczepy z genem cpe enterotoksyny (chromosomowym albo plazmidowym). Typowe kolonie na agarze TSC są czarne albo szare do żółtobrązowych (także przy słabej barwie) — barwę daje siarczek żelaza(II), który powstaje z jonów siarczkowych i żelaza(III) z podłoża. Płytki liczy się w ciągu 30 min od wyjęcia z atmosfery beztlenowej, bo barwa szybko blednie w tlenie; dłuższa inkubacja może dać nadmierne zaczernienie, a beztlenowce wytwarzające wodór mogą zaczernić całe podłoże.

PODŁOŻE TSC (skład według ISO 7937:2004, p. 5.2; ISO 15213-2 zmieniło tylko nazwę podłoża SC na TSC, bez zmiany składu). Podłoże podstawowe na 1 000 ml: enzymatyczny hydrolizat białka 15,0 g, enzymatyczny hydrolizat soi 5,0 g, ekstrakt drożdżowy 5,0 g, disiarczan(IV) disodu (Na₂S₂O₅, bezwodny) 1,0 g, cytrynian amonowo-żelazowy(III) (co najmniej 15 % żelaza) 1,0 g, agar 9–18 g; pH 7,6 ± 0,2 w 25 °C. Do każdych 100 ml podłoża podstawowego schłodzonego do 44–47 °C dodaje się tuż przed użyciem 1 ml roztworu D-cykloseryny (4,0 g w 100 ml wody, sterylizowanego przez filtrację). Dawne podłoże SC nazywano „TSC bez żółtka jaja”.

PRZEPISY. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026) nie zawiera kryteriów dla Clostridium perfringens. W wodzie do spożycia Clostridium perfringens (łącznie ze sporami) bada się metodą referencyjną PN-EN ISO 14189 (Dz.U. 2026 poz. 748) — osobny wpis Bazy wiedzy.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Dostępny tekst ISO 15213-2:2023 kończy się na p. 9.6.1.2 (przesiew kolonii na agar z krwią). Przebiegu testu fosfatazy kwaśnej i testu na podłożu SIM, obliczeń, składu podłoży z zał. B (poza TSC — według ISO 7937:2004), metod molekularnych z zał. D i charakterystyk metody nie podajemy.

Zasada metody

Określoną ilość próbki płynnej albo zawiesiny wyjściowej i kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych przenosi się na puste płytki Petriego i miesza ze stopionym podłożem selektywnym (TSC), a po zestaleniu wylewa nakładkę z tego samego podłoża, która zapobiega rozrastaniu się kolonii na powierzchni (p. 4.1, 4.3). Płytki inkubuje się beztlenowo w 37 °C przez 20 h i liczy kolonie typowe — czarne albo szare do żółtobrązowych; wybrane kolonie potwierdza się, a wynik oblicza jako liczbę potwierdzonych C. perfringens (p. 4.3–4.4). Do liczenia samych przetrwalników rozcieńczenia ogrzewa się przed posiewem 10 min w 80 °C (p. 4.1).

Zastosowania

• Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (ISO 15213-2, rozdz. 1)
• Próbki środowiskowe z produkcji i obrotu żywnością i paszami oraz próbki z produkcji pierwotnej (rozdz. 1)
• Kategorie zwalidowane: produkty mięsne gotowe do spożycia i do odgrzania, jaja i produkty jajeczne, przetworzone owoce i warzywa, preparaty i kaszki dla niemowląt, potrawy wieloskładnikowe, karma dla zwierząt domowych i pasze, próbki środowiskowe (rozdz. 1, uwaga)
• Liczenie samych przetrwalników — z obróbką 10 min w 80 °C (p. 9.3)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 7937:2005

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby Clostridium perfringens — Metoda liczenia kolonii

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens — Colony-count technique

Procedura krok po kroku

1. Próbka i rozcieńczenia

   Zawiesinę wyjściową i jeden szereg rozcieńczeń dziesiętnych przygotowuje się według ISO 6887 i normy dla danego produktu (p. 9.2); przebieg całości — zał. A (p. 9.1).

2. Przetrwalniki (opcjonalnie)

   Do liczenia samych przetrwalników ogrzać szereg rozcieńczeń w łaźni (10 ± 1) min w 80 °C, najpóźniej 15 min po przygotowaniu zawiesiny (albo przechować w topniejącym lodzie do 2 h); temperaturę mierzyć w butelce odniesienia, czas liczyć od osiągnięcia w niej 80 °C (dojście nie dłużej niż 5 min), potem od razu schłodzić do około 20 °C (p. 9.3).

   🌡 Temperatura: 80 °C

3. Posiew

   Do dwóch jałowych płytek 90 mm przenieść po 1 ml próbki płynnej albo zawiesiny wyjściowej (10⁻¹), do jednej — 1 ml kolejnego rozcieńczenia; w razie potrzeby dalsze rozcieńczenia, każde nową pipetą; przy małych liczbach — 10 ml zawiesiny na trzy płytki 140 mm (p. 9.4.1–9.4.3).

4. Zalanie i nakładka

   Wlać 12–15 ml (90 mm) albo 30–35 ml (140 mm) agaru TSC o temperaturze 44–47 °C, wymieszać przez obracanie płytek i zestalić na chłodnej poziomej powierzchni; potem wlać nakładkę około 5 ml (90 mm) albo 12 ml (140 mm) tego samego podłoża (p. 9.4.5–9.4.7).

   🌡 Temperatura: 44–47 °C

5. Inkubacja

   Płytki odwrócić i inkubować beztlenowo w 37 °C (p. 9.4.8).

   🌡 Temperatura: 37 ± 1 °C

6. Liczenie

   Po (20 ± 2) h policzyć kolonie typowe — czarne albo szare do żółtobrązowych — w ciągu 30 min od wyjęcia płytek z atmosfery beztlenowej; wziąć płytki z mniej niż 150 koloniami (90 mm) albo 365 (140 mm) i z każdej wybrać losowo 5 kolonii do potwierdzenia (p. 9.5).

7. Przesiew

   Każdą wybraną kolonię posiać na agar Columbia z krwią (albo inne podłoże bogate) i inkubować beztlenowo (20 ± 2) h w 37 °C; przy kilku postaciach kolonii — po jednej z każdej; po inkubacji płytki można trzymać w 5 °C do 48 h (p. 9.6.1).

   🌡 Temperatura: 37 °C

8. Potwierdzenie

   Świeżo wyrosłe, dobrze izolowane kolonie potwierdza się testem fosfatazy kwaśnej albo testem na podłożu SIM; metody alternatywne — po walidacji według ISO 16140-4 albo ISO 16140-6 (p. 9.6.1.2).

9. Wynik

   Liczba potwierdzonych C. perfringens w jtk na 1 g, 1 ml, 1 cm² albo na urządzenie do pobierania próbek (p. 3.4, 4.4).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Badania liczby Clostridium perfringens prowadzi się tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach, pod nadzorem doświadczonego mikrobiologa, z dużą starannością przy usuwaniu wszystkich inkubowanych materiałów (ostrzeżenie ISO 15213-2)
• Norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP należy do użytkownika (ostrzeżenie ISO 15213-2)

Najczęstsze pytania