🦠 Clostridium perfringens w wodzie

Mikrobiologia PN-EN ISO 14189

Przegląd

STATUS (stan na 29.10.2026). PN-EN ISO 14189:2016-10 — wersja polska, opublikowana 04.07.2017, wprowadza EN ISO 14189:2016 [IDT] i ISO 14189:2013 [IDT]. Norma aktualna — bez adnotacji o wycofaniu. ISO 14189:2013 (wydanie pierwsze) ma w katalogu status normy obowiązującej.

ZAKRES (rozdz. 1). Oznaczanie ilościowe form wegetatywnych i przetrwalników Clostridium perfringens metodą filtracji membranowej w próbkach wody przeznaczonej do spożycia. Metodę można stosować do wszystkich rodzajów wód, jeżeli nie zawierają cząstek ani substancji koloidalnych przeszkadzających w filtracji.

ZNACZENIE (wprowadzenie). C. perfringens jest uznanym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego. W przewodzie pokarmowym zwierząt i ludzi te Gram-dodatnie bakterie tworzą przetrwalniki, odporne na ogrzewanie w porównaniu z formami wegetatywnymi; przetrwalniki występują też w próbkach środowiskowych. Przeżywają w wodzie miesiącami, znacznie dłużej niż wegetatywne bakterie wskaźnikowe pochodzenia kałowego, dlatego ich obecność może wskazywać na odległe w czasie albo okresowe zanieczyszczenie kałowe. Monitoring C. perfringens przydaje się do oceny zasobów wody i do kontroli etapów uzdatniania; przetrwalniki nie zawsze są inaktywowane rutynową dezynfekcją, taką jak chlorowanie.

DEFINICJE (rozdz. 3). Domniemane C. perfringens — bakterie dające na agarze TSC kolonie we wszystkich odcieniach czerni albo szarości do żółtobrązowych, nawet przy słabym zabarwieniu, po beztlenowej inkubacji w (44 ± 1) °C przez (21 ± 3) h; kolonie na sączku nie zawsze wyraźnie czernieją, dlatego liczy się także słabo zabarwione. Potwierdzone C. perfringens — bakterie dające kolonie charakterystyczne na agarze TSC i mające enzym kwaśną fosfatazę.

PRZEPISY. Woda do spożycia: Clostridium perfringens (łącznie ze sporami) 0 jtk/100 ml — parametr wskaźnikowy, mierzony, jeżeli ocena ryzyka wskazuje, że jest to właściwe (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. C tab. 1 lp. 2 i objaśnienie 3); metodą referencyjną jest PN-EN ISO 14189 (zał. nr 4 cz. A).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się na p. 8.3 (rozcieńczanie próbek). Filtracja (p. 8.4), inkubacja i odczyt (p. 8.5), przebieg potwierdzania (p. 8.6), wyrażanie wyników (rozdz. 9), zapewnienie jakości (rozdz. 11), skład podłoży i odczynnika z kwaśną fosfatazą (zał. A) oraz dane walidacji (zał. B) są poza nim. Skład agaru TSC, odczynnik do kwaśnej fosfatazy i przebieg potwierdzania podajemy jako przykład z brytyjskiej metody urzędowej dla wody do picia (The Microbiology of Drinking Water, cz. 6, 2021), opartej na tej samej zasadzie — w krokach oznaczone „przykład”.

Zasada metody

Odmierzoną objętość próbki albo jej rozcieńczenie przesącza się przez sączek membranowy o wielkości porów 0,45 µm, który zatrzymuje przetrwalniki bakterii z rodzaju Clostridium. Sączek inkubuje się na podłożu selektywno-różnicującym — agarze tryptozowo-siarczynowo-cykloserynowym (TSC) — beztlenowo w (44 ± 1) °C przez (21 ± 3) h. C. perfringens daje zwykle kolonie czarne albo szare do żółtobrązowych, bo redukuje siarczyn do siarczku, który reaguje z solą żelaza(III) w podłożu. Kolonie charakterystyczne liczy się i potwierdza, a wynik oblicza jako liczbę kolonii w objętości próbki. Gdy potrzebna jest liczba samych przetrwalników, próbkę najpierw ogrzewa się w (60 ± 2) °C, aby inaktywować formy wegetatywne. Cykloseryna hamuje wzrost bakterii z rodzaju Bacillus, a inkubacja w 44 °C zwiększa selektywność wobec C. perfringens (rozdz. 4).

Zastosowania

• Woda przeznaczona do spożycia oraz inne wody bez cząstek i koloidów utrudniających filtrację (rozdz. 1)
• Woda do spożycia — C. perfringens (łącznie ze sporami) 0 jtk/100 ml, gdy wynika to z oceny ryzyka; metoda referencyjna (Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 1 cz. C i zał. nr 4 cz. A)
• Ocena zasobów wody i kontrola skuteczności etapów uzdatniania (wprowadzenie)
• Wykrywanie odległego w czasie albo okresowego zanieczyszczenia kałowego — przetrwalniki przeżywają w wodzie miesiącami (wprowadzenie)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 14189:2016-10

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Clostridium perfringens — Metoda filtracji membranowej

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Clostridium perfringens — Method using membrane filtration

Procedura krok po kroku

1. Transport i przechowanie próbki

   Badanie rozpocząć jak najszybciej, najlepiej w dniu pobrania; próbki chłodzić w transporcie, najlepiej do (5 ± 3) °C. Zalecany najdłuższy czas łącznie z transportem: 12 h dla form wegetatywnych i 24 h dla przetrwalników; nie może przekroczyć 18 h i 72 h (p. 8.1).

2. Ogrzanie — tylko przy liczeniu przetrwalników

   Próbkę dobrze wymieszać i ogrzać w łaźni wodnej do (60 ± 2) °C na (15 ± 1) min; ogrzewana objętość ma być większa od badanej. Temperaturę kontroluje się termometrem w butelce odniesienia tej samej wielkości, z tą samą objętością wody o tej samej temperaturze początkowej; dojście do (60 ± 2) °C nie może trwać dłużej niż 15 min — skraca je cyrkulacja wody w łaźni (p. 8.2).

   🌡 Temperatura: 60 ± 2 °C

3. Dobór objętości i rozcieńczenia

   Objętość próbki albo rozcieńczenie (po ewentualnym ogrzaniu) dobrać tak, by na sączku o średnicy 47–50 mm wyrosło, jeśli to możliwe, 10–80 kolonii; rozcieńczenia — według ISO 8199 (p. 8.3).

4. Filtracja i inkubacja

   Przesączyć porcję przez sączek 0,45 µm, sączek ułożyć na agarze TSC i inkubować beztlenowo w (44 ± 1) °C przez (21 ± 3) h (rozdz. 4). Lejki używane do próbek z przetrwalnikami muszą być jałowe — gotowanie nie wystarcza (p. 5.2).

   🌡 Temperatura: 44 ± 1 °C

5. Liczenie kolonii domniemanych

   Liczyć kolonie we wszystkich odcieniach czerni albo szarości do żółtobrązowych, także słabo zabarwione — na sączku nie zawsze wyraźnie czernieją (p. 3.1).

6. Potwierdzenie — kwaśna fosfataza

   Potwierdzone C. perfringens to kolonie charakterystyczne z kwaśną fosfatazą (p. 3.2); do subkultury służy agar z krwią, podłoże Columbia albo inne bogate podłoże (p. 6.2.2). Przykład (metoda brytyjska, 2021): kolonie przenieść na podłoże Columbia, inkubować beztlenowo w 37 °C przez (21 ± 3) h, nanieść 2–3 krople odczynnika — fioletowe albo ciemnobrązowe zabarwienie w ciągu 3 min oznacza wynik dodatni; równolegle kontrola dodatnia i ujemna.

7. Wynik

   Liczbę kolonii potwierdzonych odnosi się do objętości przesączonej próbki (rozdz. 4); zasady obliczania — rozdz. 9 i ISO 8199, poza dostępnym tekstem normy.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Osoby korzystające z normy powinny znać zwykłą praktykę laboratoryjną; norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP i zgodności z przepisami krajowymi należy do użytkownika (ostrzeżenie normy)
• Badania według normy muszą wykonywać odpowiednio wykwalifikowani pracownicy (ostrzeżenie normy)

Najczęstsze pytania