🌿 Chlorofil a w wodzie

Fizykochemia PN-ISO 10260

Przegląd

STATUS (stan na 03.11.2026). PN-ISO 10260:2002 — wersja polska, opublikowana 20.12.2002, wprowadza ISO 10260:1992 [IDT]; karta PKN nie ma adnotacji o wycofaniu. ISO 10260:1992 (wydanie pierwsze) ma w katalogu ISO etap „potwierdzona po przeglądzie” (90.93). Od 08.01.2025 jest też PN-EN 17899:2025-01 (wersja angielska; wprowadza EN 17899:2024) — spektrofotometryczne oznaczanie chlorofilu-a metodą ekstrakcji etanolem do rutynowego monitorowania jakości wody, z poprawką na feopigmenty, dla wszystkich rodzajów wód powierzchniowych, także morskich; jej karta nie podaje, że zastępuje PN-ISO 10260. Ten opis dotyczy PN-ISO 10260.

ZAKRES (rozdz. 1). Chlorofil a w fitoplanktonie naturalnych wód powierzchniowych i w testach wzrostu glonów; przy odpowiednim pobieraniu — także w zbiorowiskach fitobentosu (zał. A). Chlorofil b, chlorofil c i część metabolitów nie wpływają na wynik; feopigmenty oznacza się półilościowo — do korekty oznaczenia chlorofilu a i jako wskaźnik udziału nieaktywnej biomasy glonów. Chlorofil jest wrażliwy na światło i tlen, zwłaszcza po ekstrakcji, dlatego próbek nie wystawia się na silne światło ani na powietrze. Barwnik niektórych rzadko występujących bakterii fototroficznych (np. Chlorobium) zakłóca oznaczanie.

ZASADA (rozdz. 3). Glony i inną zawiesinę zatrzymuje się na filtrze, barwniki ekstrahuje gorącym etanolem, a stężenie chlorofilu a i feopigmentów oblicza z różnicy absorbancji przy 665 nm przed zakwaszeniem ekstraktu i po nim. Ogrzewanie z etanolem do 75 °C przez 5 min dezaktywuje chlorofilazę i przyspiesza uwalnianie barwników. Absorbancję przy 665 nm koryguje się o absorbancję przy 750 nm, bo w ekstrakcie może zostać lekkie zmętnienie, także po zakwaszeniu.

PRZEBIEG (rozdz. 6 i 7). Próbki pobiera się według ISO 5667-1 i ISO 5667-2; przechowywanie w chłodzie i ciemności krócej niż 8 h jest dopuszczalne, ale należy go unikać — filtrację i ekstrakcję najlepiej wykonać od razu. Filtruje się odmierzoną objętość próbki (zwykle 0,1–2 l), filtr suszy próżnią i przenosi do naczynia ekstrakcyjnego. Wariant A: 30–40 ml etanolu ogrzanego do 75 °C, rozdrobnienie filtra homogenizatorem prętowym, ekstrakcja co najmniej 3 min (zwykle kilka godzin albo przez noc w temperaturze pokojowej), sączenie do kolby 50 ml albo 100 ml i dopełnienie etanolem — objętość ekstraktu Ve. Wariant B: dokładnie odmierzona objętość etanolu Ve (zwykle 20 ml albo 25 ml) w szczelnie zamkniętym naczyniu, 5 min w łaźni 75 °C, 15 min studzenia, sączenie bez przemywania albo wirowanie. Ekstrakty można przechować w lodówce przez noc (najwyżej 3 dni), a surowe ekstrakty w szczelnych naczyniach z brązowego szkła — poniżej −25 °C do 30 dni; zamrożonych próbek wody ani filtrów z zawiesiną się nie przechowuje.

POMIAR I OBLICZENIE (7.4, rozdz. 8). Absorbancję przy 665 nm i 750 nm mierzy się wobec etanolu, potem zakwasza część ekstraktu (0,01 ml kwasu solnego 3 mol/l na 10 ml) i po 5–30 min mierzy ponownie. Absorbancja przy 665 nm powinna wynosić 0,01–0,8 — na początek norma proponuje 0,5 l próbki, filtr 50 mm, 20 ml etanolu i kuwetę 5 cm. Stężenie chlorofilu a ρc = (A − Aa) × 29,6 × Ve/(Vs × d), a feopigmentów ρp = Aa × 20,8 × Ve/(Vs × d) − ρc, gdzie A i Aa to absorbancje (665 nm minus 750 nm) przed zakwaszeniem i po nim, Ve — objętość ekstraktu w ml, Vs — objętość przesączonej próbki w l, d — długość drogi optycznej w cm. Współczynniki wynikają z operacyjnego współczynnika absorpcji chlorofilu a w etanolu 90 % (82) i stosunku A/Aa = 1,7 dla czystego chlorofilu a. Wynik podaje się w µg/l (mg/m³) z co najwyżej dwiema cyframi znaczącymi albo jednym miejscem po przecinku. W badaniach międzylaboratoryjnych zmienność między laboratoriami wynosiła 5–11 % dla chlorofilu a i 6–46 % dla feopigmentów.

DLACZEGO ETANOL (zał. A.2). Aceton, zalecany od 1966 r. przez UNESCO-SCOR, w niektórych przypadkach ekstrahuje słabo; gorący etanol i metanol są równie skuteczne i wyraźnie skuteczniejsze od zimnego acetonu, ale metanol sprawia trudności przy zakwaszaniu i jest toksyczny — dlatego norma zaleca etanol jako ekstrahent odniesienia dla prób słodkowodnych i morskich. Absorbancja chlorofilu a w acetonie przy 665 nm jest o 2–3 % wyższa niż w etanolu.

PRZEPISY I WYTYCZNE. Monitoring jednolitych części wód: metodyką referencyjną wskaźnika chlorofil „a” (1.1.5) jest metoda spektrofotometryczna według PN-ISO 10260 i przewodnika HELCOM do monitoringu chlorofilu a (Dz.U. 2021 poz. 1576, zał. nr 8). W klasyfikacji stanu ekologicznego chlorofil a jest wskaźnikiem elementu „fitoplankton” dla wód przejściowych i przybrzeżnych, z wartościami granicznymi klas w µg/l (Dz.U. 2021 poz. 1475, zał. nr 9 i 10). Wytyczne HELCOM (2017; drugie źródło) opierają się na ISO 10260, ale stosują etanol co najmniej 96 % (10 ml, bez suszenia filtra), filtry GF/F, wirowanie ekstraktu i pomiar bez poprawki na feopigmenty, ze współczynnikiem absorpcji 83 dla etanolu 96 % i absorbancją 0,1–0,8 przy 663–665 nm.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Klas trofii wód ani „typowych” stężeń chlorofilu — norma ich nie podaje; wartości graniczne klas jakości dla wód przejściowych i przybrzeżnych zawiera rozporządzenie Dz.U. 2021 poz. 1475.

Zasada metody

Glony z odmierzonej objętości wody zatrzymuje się na filtrze z włókna szklanego, a barwniki ekstrahuje gorącym etanolem (90 %, 75 °C). Absorbancję ekstraktu mierzy się przy 665 nm i przy 750 nm (poprawka na zmętnienie) przed zakwaszeniem kwasem solnym i po nim. Z różnicy absorbancji oblicza się stężenie chlorofilu a, a z absorbancji po zakwaszeniu — feopigmentów: ρc = (A − Aa) × 29,6 × Ve/(Vs × d).

Zastosowania

• Fitoplankton naturalnych wód powierzchniowych (rozdz. 1)
• Testy wzrostu glonów (rozdz. 1)
• Fitobentos — przy odpowiednim pobieraniu (rozdz. 1, zał. A)
• Monitoring jednolitych części wód — metodyka referencyjna wskaźnika chlorofil „a” (Dz.U. 2021 poz. 1576, zał. nr 8 pkt 1.1.5)
• Klasyfikacja stanu ekologicznego wód przejściowych i przybrzeżnych — wskaźnik elementu „fitoplankton” (Dz.U. 2021 poz. 1475, zał. nr 9 i 10)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-ISO 10260:2002

Tytuł (PL)

Jakość wody — Pomiar parametrów biochemicznych — Spektrometryczne oznaczanie stężenia chlorofilu a

Title (EN)

Water quality — Measurement of biochemical parameters — Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration

Procedura krok po kroku

1. Pobranie próbki

   Pobierz próbkę według ISO 5667-1 i ISO 5667-2; chroń ją przed silnym światłem i powietrzem; przechowywanie w chłodzie i ciemności krócej niż 8 h jest dopuszczalne, ale filtrację i ekstrakcję najlepiej wykonać od razu (1.3, rozdz. 6).

2. Filtracja

   Wymieszaj próbkę i przesącz odmierzoną objętość Vs (zwykle 0,1–2 l) przez filtr z włókna szklanego; filtr wysusz próżnią i przenieś do naczynia ekstrakcyjnego, nie dotykając go palcami (7.1).

3. Ekstrakcja — wariant A

   Zalej filtr 30–40 ml etanolu ogrzanego do 75 °C, po kilku minutach rozdrobnij go homogenizatorem, ekstrahuj co najmniej 3 min, przesącz do kolby 50 ml albo 100 ml, przemyj naczynie etanolem i dopełnij do kreski — to objętość Ve (7.2).

4. Ekstrakcja — wariant B

   Dodaj dokładnie odmierzoną objętość etanolu Ve (zwykle 20 ml albo 25 ml), szczelnie zamknij, ogrzewaj 5 min w łaźni 75 °C, studź 15 min, przesącz bez przemywania albo odwiruj do klarownego ekstraktu (7.3).

5. Pomiar przed zakwaszeniem

   Zmierz absorbancję klarownego ekstraktu przy 665 nm i 750 nm wobec etanolu; absorbancja przy 665 nm powinna wynosić 0,01–0,8 — dobierz objętość próbki, ekstrahenta i kuwetę (7.4.1).

6. Zakwaszenie i drugi pomiar

   Zakwaś część ekstraktu (zwykle 5–10 ml) kwasem solnym 3 mol/l — 0,01 ml na 10 ml — i po 5–30 min zmierz ponownie absorbancję przy 665 nm i 750 nm (7.4.2).

7. Obliczenie

   ρc = (A − Aa) × 29,6 × Ve/(Vs × d), ρp = Aa × 20,8 × Ve/(Vs × d) − ρc, gdzie A = A665 − A750 przed zakwaszeniem, a Aa — po zakwaszeniu; wynik w µg/l z co najwyżej dwiema cyframi znaczącymi (rozdz. 8).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Etanol — zharmonizowana klasyfikacja CLP: H225 (wysoce łatwopalna ciecz i pary); w wariancie B ekstrakcja w łaźni 75 °C w szczelnie zamkniętych naczyniach
• Kwas solny do zakwaszania przygotowuje się według karty charakterystyki

Najczęstsze pytania