🔴 Campylobacter w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 10272-1

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 10272-1:2017-08 — wersja angielska, opublikowana 23.08.2017, wprowadza EN ISO 10272-1:2017 i ISO 10272-1:2017 [IDT]; zastąpiła PN-EN ISO 10272-1:2007 (wersja polska) z poprawką Ap1:2008. ZMIANA PN-EN ISO 10272-1:2017-08/A1:2023-08 (wersja angielska, opublikowana 04.08.2023) wprowadza ISO 10272-1:2017/Amd 1:2023 (25.01.2023): nowa definicja Campylobacter, molekularne potwierdzanie i identyfikacja gatunków termotolerancyjnych (zał. D i E), suplement wzrostowy w bulionie Prestona i zmiany w badaniu przydatności podłoży. Wydanie z 2017 r. dodało do zakresu próbki z produkcji pierwotnej, bulion Prestona jako drugi bulion namnażający i posiew bezpośredni na mCCD, a potwierdzenie wzrostem mikroaerofilnym w 25 °C i tlenowym w 41,5 °C zastąpiło badaniem wzrostu tlenowego w 25 °C.

ZAKRES (rozdz. 1, p. 3.1 w brzmieniu zmiany A1). Wykrywanie Campylobacter przez namnażanie albo posiew bezpośredni w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt, w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością i paszami oraz w próbkach z produkcji pierwotnej (kał zwierząt, kurz, wymazy). Norma dotyczy termotolerancyjnych gatunków ważnych dla zdrowia człowieka — najczęściej C. jejuni i C. coli, ale też C. lari, C. upsaliensis i innych. Campylobacter tworzy charakterystyczne kolonie na podłożach selektywnych, np. agarze mCCD, w atmosferze mikroaerofilnej w 41,5 °C. Według rozdziału 7 podręcznika BAM (FDA) C. jejuni, C. coli i C. lari to ponad 99 % izolatów od ludzi (C. jejuni — 90 %), dawka zakaźna C. jejuni wynosi 500–10 000 komórek, zależnie od szczepu, uszkodzenia komórek i wrażliwości gospodarza, a zakażenia wiązano m.in. z niepasteryzowanym mlekiem, mięsem, drobiem, skorupiakami, owocami i warzywami.

TRZY PROCEDURY (p. 4.1, 9.1). A — namnażanie w bulionie Boltona: próbki z małą liczbą Campylobacter i małą florą towarzyszącą albo z komórkami uszkodzonymi, np. produkty gotowane lub mrożone; B — namnażanie w bulionie Prestona: mała liczba Campylobacter i duża flora towarzysząca, np. surowe mięso (także drobiowe) i surowe mleko; C — posiew bezpośredni: duża liczba Campylobacter, np. kał, treść jelit ślepych drobiu, surowe mięso drobiowe (można ją łączyć z ISO 10272-2 do liczenia). Gdy mało wiadomo o próbce, procedurę C prowadzi się równolegle z A i/lub B. Bulion Prestona lepiej tłumi florę oporną na β-laktamy trzeciej generacji, np. cefoperazon, który jest w bulionie Boltona i w agarze mCCD; według zmiany A1 bulion Prestona bywa zbyt selektywny dla części szczepów (zwłaszcza C. coli) — suplement wzrostowy poprawia ich odzysk.

ATMOSFERA I PRÓBKI (p. 6.5, rozdz. 7, p. 9.5.1). Atmosfera mikroaerofilna: tlen (5 ± 2) %, ditlenek węgla (10 ± 3) %, opcjonalnie wodór do 10 %, reszta azot — w szczelnych słojach z wkładami gazotwórczymi (ściśle według producenta) albo przez napełnienie słoja lub cieplarki mieszaniną gazów. Campylobacter jest bardzo wrażliwy na zamrażanie, ale najlepiej przeżywa w niskiej temperaturze — próbek się nie zamraża, przechowuje w 3 °C, bada jak najszybciej i chroni przed wysychaniem; w powietrzu szybko traci zdolność wzrostu, więc potwierdzanie prowadzi się bez zwłoki.

PRZEPISY. Kryterium higieny procesu dla Campylobacter w rozporządzeniu Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026) dotyczy liczby, nie wykrywania: tusze brojlerów po schłodzeniu, n = 50 próbek z 10 kolejnych sesji, c = 10 od 01.01.2025, m = M = 1 000 jtk/g, metoda referencyjna EN ISO 10272-2 (pkt 2.1.9). Część 1 nie jest metodą referencyjną żadnego kryterium tego rozporządzenia.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się na p. 9.5.1. Wyboru kolonii do potwierdzenia, przebiegu badania morfologii i ruchliwości, przesiewu na agar z krwią, testu oksydazy i wzrostu tlenowego w 25 °C (p. 9.5.2–9.5.5), identyfikacji gatunków poza tablicą 2 ze zmiany A1 oraz składu bulionu Boltona, agaru mCCD i drugiego podłoża (zał. B) nie podajemy.

Zasada metody

Wykrywanie wymaga trzech kolejnych etapów (zał. A): namnażania w selektywnym podłożu płynnym albo posiewu bezpośredniego, izolacji na stałym podłożu selektywnym i potwierdzenia (p. 4.1). W procedurze A porcję badaną dodaje się do bulionu Boltona i inkubuje mikroaerofilnie 4–6 h w 37 °C, potem 44 h w 41,5 °C; w procedurze B — do bulionu Prestona, 24 h w 41,5 °C (p. 4.2). Z hodowli posiewa się agar mCCD (w procedurze A także drugie podłoże selektywne o innych czynnikach selekcyjnych), a w procedurze C porcję badaną posiewa się na mCCD bezpośrednio; płytki inkubuje się mikroaerofilnie w 41,5 °C i ogląda po 44 h (p. 4.3). Kolonie podejrzane bada się mikroskopowo (morfologia i ruchliwość), przesiewa na nieselektywny agar z krwią i potwierdza oksydazą i testem wzrostu tlenowego w 25 °C; gatunek można opcjonalnie określić testami biochemicznymi lub metodami molekularnymi (p. 4.4).

Zastosowania

• Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1)
• Próbki środowiskowe z produkcji i obrotu żywnością i paszami (rozdz. 1)
• Próbki z produkcji pierwotnej: kał zwierząt, kurz, wymazy (rozdz. 1)
• Produkty gotowane lub mrożone — procedura A; surowe mięso (także drobiowe) i surowe mleko — procedura B; kał, treść jelit ślepych drobiu, surowe mięso drobiowe — procedura C (p. 9.1)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 10272-1:2017-08 + A1:2023-08

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. — Część 1: Metoda wykrywania

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 1: Detection method

Procedura krok po kroku

1. Próbka

   Próbek się nie zamraża — przechowuje się je w 3 °C, bada jak najszybciej i chroni przed wysychaniem (rozdz. 7); próbkę do badań przygotowuje się według ISO 6887 (rozdz. 8).

2. Zawiesina wyjściowa (A, B)

   Porcję badaną miesza się z bulionem namnażającym ogrzanym do temperatury pokojowej w proporcji 1 : 10 — zwykle 10 g albo 10 ml na 90 ml bulionu Boltona (A) albo Prestona (B) — i homogenizuje według ISO 7218 (p. 9.2.1–9.2.3).

3. Posiew bezpośredni (C)

   Kał i treść jelit ślepych nanosi się ezą albo jałowym wymazem na pierwszą połowę płytki mCCD i rozsiewa drugą ezą; inne próbki miesza się z płynem (np. roztworem soli fizjologicznej z peptonem albo bulionem Prestona, np. 1 : 2) i posiewa ezą albo rozprowadza na płytce (p. 9.2.4).

4. Namnażanie

   Procedura A: mikroaerofilnie 4–6 h w 37 °C, potem (44 ± 4) h w 41,5 °C; procedura B: mikroaerofilnie (24 ± 2) h w 41,5 °C (p. 9.3).

   🌡 Temperatura: 37 °C → 41,5 °C

5. Izolacja

   Ezą 10 µl posiać hodowlę na agar mCCD, a w procedurze A także na drugie podłoże selektywne; płytki inkubować mikroaerofilnie w 41,5 °C (p. 9.4.1–9.4.3).

   🌡 Temperatura: 41,5 °C

6. Odczyt

   Po (44 ± 4) h szukać kolonii typowych lub podejrzanych: szarawych, często z metalicznym połyskiem, płaskich i wilgotnych, ze skłonnością do rozpływania (mniejszą na suchszym podłożu); możliwe są inne postacie kolonii (p. 9.4.3).

7. Potwierdzenie

   Bez zwłoki, bo Campylobacter szybko traci w powietrzu zdolność wzrostu: morfologia i ruchliwość w mikroskopie, przesiew na nieselektywny agar z krwią, oksydaza i wzrost tlenowy w 25 °C (p. 4.4, 9.5.1); jako szczepy kontrolne norma podaje C. jejuni WDCM 00005 (dodatni) i E. coli WDCM 00013 (ujemny). Zamiast tych testów albo obok nich — PCR, metody serologiczne, MALDI-TOF po sprawdzeniu przydatności (p. 9.5.1; PCR — zmiana A1, zał. D).

8. Identyfikacja (opcjonalnie)

   Katalaza, hydroliza hipuranu i octanu indoksylu według tablicy 2 w brzmieniu zmiany A1: C. jejuni +/+/+, C. coli +/−/+, C. lari +/−/−, C. upsaliensis − albo słaba/−/+; octan indoksylu — niebieska barwa w ciągu 5–10 min, przy niejasnym wyniku po kolejnych 20 min; zamiast testów biochemicznych — metody molekularne z zał. E (p. 9.6, zmiana A1).

9. Wynik

   Obecność albo nieobecność Campylobacter w określonej ilości produktu (p. 3.2).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Badania na obecność Campylobacter prowadzi się tylko w odpowiednio wyposażonych laboratoriach, pod nadzorem doświadczonego mikrobiologa, z dużą starannością przy usuwaniu wszystkich inkubowanych materiałów (ostrzeżenie normy)
• Norma nie omawia wszystkich zagadnień bezpieczeństwa — ustalenie zasad BHP należy do użytkownika (ostrzeżenie normy)

Najczęstsze pytania