🧫 Bacillus cereus w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 7932

Przegląd

STATUS (stan na 02.11.2026). PN-EN ISO 7932:2005 — wersja polska, opublikowana 16.12.2005, wprowadza EN ISO 7932:2004 i ISO 7932:2004 [IDT]; zastąpiła wersję angielską tej normy i PN-A-86034-14:1993. ZMIANA PN-EN ISO 7932:2005/A1:2020-09 (wersja angielska, opublikowana 16.09.2020) wprowadza ISO 7932:2004/Amd 1:2020 „Włączenie badań opcjonalnych” (31.03.2020). ISO 7932:2004 (wydanie trzecie, 16.06.2004) jest aktualne; zastąpiło wydanie z 1993 r. z poprawką z 1997 r. — dawne testy potwierdzające (podłoże MYP, fermentacja glukozy, reakcja Voges-Proskauera, redukcja azotanów) zastąpiono reakcją hemolizy i podłożem MYP.

ZAKRES (rozdz. 1). Oznaczanie liczby żywych przypuszczalnych B. cereus metodą liczenia kolonii w 30 °C w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt oraz w próbkach środowiskowych z produkcji i obrotu żywnością. Potwierdzenie ograniczono do typowego wyglądu na agarze MYP i testu hemolizy, dlatego wynik dotyczy „przypuszczalnych” B. cereus — nie odróżnia ich od rzadziej spotykanych B. anthracis, B. thuringiensis, B. weihenstephanensis i B. mycoides; przy podejrzeniu B. anthracis pomaga dodatkowy test ruchliwości. Zmiana A1 dodaje uwagę o dużej różnorodności grupy B. cereus — 7 grup filogenetycznych i rosnąca liczba gatunków.

PODŁOŻE MYP (p. 5.2). Podłoże podstawowe: ekstrakt wołowy 1,0 g, enzymatyczny hydrolizat kazeiny 10,0 g, D-mannitol 10,0 g, chlorek sodu 10,0 g, czerwień fenolowa 0,025 g, agar 12–18 g, woda 900 ml; pH podłoża kompletnego po sterylizacji 7,2 ± 0,2 w 25 °C. Na 90 ml podłoża podstawowego dodaje się 1,0 ml roztworu siarczanu polimyksyny B (10⁶ j.m. w 100 ml wody) i 10,0 ml emulsji żółtka jaja (żółtka z 4 objętościami wody jałowej, 2 h w 44–47 °C, potem 18–24 h w (5 ± 3) °C; przechowywanie do 72 h). Płytki z 15–20 ml podłoża suszy się przed użyciem w 37–55 °C. Według karty podłoża MYP i rozdziału 14 podręcznika BAM (FDA) B. cereus nie fermentuje mannitolu i wytwarza lecytynazę, więc tworzy różowe kolonie otoczone strefą precypitatu, a polimyksyna ogranicza wzrost bakterii Gram-ujemnych.

PRZETRWALNIKI (wprowadzenie, p. 0.2). Przetrwalniki większości szczepów B. cereus łatwo kiełkują na powierzchni podłoży do liczenia i zwykle nie trzeba szoku cieplnego; gdy jest pożądany — np. do liczenia przetrwalników albo zahamowania komórek wegetatywnych — zaleca się 10 min w 80 °C. Według rozdziału 14 podręcznika BAM (FDA) B. cereus to tlenowa bakteria przetrwalnikująca, często obecna w glebie, na warzywach i w wielu surowych i przetworzonych produktach spożywczych.

BADANIA OPCJONALNE (zmiana A1, p. 9.5, zał. C–F). Dla wyizolowanych szczepów grupy B. cereus, do badań uzupełniających (np. epidemiologicznych): PCR wykrywający warianty cytK-1 i cytK-2 genu cytotoksyny K (cytK-1 identyfikuje B. cytotoxicus), PCR genu ces syntetazy cereulidu — toksyny wymiotnej (ilościowe oznaczanie cereulidu opisuje ISO 18465), test ruchliwości do przesiewu B. anthracis i mikroskopowe badanie kryształu parasporalnego B. thuringiensis. W zmianie używa się określenia „grupa B. cereus” zamiast „przypuszczalne B. cereus”. Według rozdziału 14 podręcznika BAM (FDA) zatrucie ma dwie postaci: biegunkową (okres inkubacji 4–16 h, objawy przez 12–24 h) i wymiotną (1–5 h po spożyciu); dochodzi do niego, gdy żywność po przygotowaniu przechowuje się przez kilka godzin bez należytego chłodzenia.

PRZEPISY. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 (tekst skonsolidowany, stan 01.07.2026), pkt 2.2.11: preparaty w proszku do początkowego żywienia niemowląt i żywność dietetyczna w proszku specjalnego przeznaczenia medycznego przeznaczona dla niemowląt w wieku do sześciu miesięcy — przypuszczalne Bacillus cereus, n = 5, c = 1, m = 50 jtk/g, M = 500 jtk/g, metoda EN/ISO 7932, koniec procesu produkcji; 1 ml inokulum nanosi się na płytkę Petriego o średnicy 140 mm lub na trzy płytki Petriego o średnicy 90 mm (przypis 10).

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Publicznie dostępny tekst normy kończy się w p. 9.3 (wybór płytek do liczenia). Opisu kolonii typowych w normie, liczby kolonii do potwierdzenia, przebiegu testu hemolizy (p. 9.4), obliczeń (rozdz. 10, zał. A) i danych precyzji nie podajemy — wygląd kolonii i hemolizę opisujemy według rozdziału 14 podręcznika BAM (FDA).

Zasada metody

Określoną ilość próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej i kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych posiewa się powierzchniowo na stałe podłoże selektywne (MYP) w płytkach Petriego i inkubuje tlenowo w 30 °C przez 18–48 h (p. 4.1–4.2). Liczbę B. cereus w 1 g albo 1 ml oblicza się z liczby kolonii potwierdzonych na płytkach z rozcieńczeń dających wynik znaczący (p. 4.3). Potwierdzenie obejmuje typowy wygląd kolonii na MYP i test hemolizy na agarze z krwią baranią (rozdz. 1, przedmowa).

Zastosowania

• Produkty przeznaczone do spożycia przez ludzi i do żywienia zwierząt (rozdz. 1)
• Próbki środowiskowe z produkcji i obrotu żywnością (rozdz. 1)
• Preparaty w proszku do początkowego żywienia niemowląt i żywność dietetyczna w proszku specjalnego przeznaczenia medycznego dla niemowląt do sześciu miesięcy — kryterium higieny procesu (rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, pkt 2.2.11)
• Badania uzupełniające wyizolowanych szczepów grupy B. cereus: geny cytotoksyny K i cereulidu, przesiew B. anthracis, kryształ B. thuringiensis (zmiana A1, p. 9.5)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 7932:2005 + A1:2020-09

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby przypuszczalnych Bacillus cereus — Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30 °C

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30 degrees C

Procedura krok po kroku

1. Próbka i rozcieńczenia

   Próbkę do badań, zawiesinę wyjściową i rozcieńczenia przygotowuje się według ISO 6887-1 i normy dla danego produktu (rozdz. 8, p. 9.1).

2. Posiew

   Jałową pipetą przenieść 0,1 ml próbki ciekłej albo zawiesiny wyjściowej na każdą z dwóch płytek z MYP; powtórzyć z kolejnymi rozcieńczeniami. Przy małych liczbach B. cereus — 1,0 ml na płytkę 140 mm albo na trzy płytki 90 mm, w dwóch powtórzeniach (p. 9.2.1–9.2.2).

3. Rozprowadzenie

   Inokulum rozprowadzić jak najszybciej, nie dotykając ścianek płytki, nową jałową głaszczką dla każdej płytki; płytki z pokrywkami zostawić na około 15 min w temperaturze otoczenia do wchłonięcia inokulum (p. 9.2.3).

4. Inkubacja

   Płytki odwrócić i inkubować 18–24 h w 30 °C; gdy kolonie nie są wyraźnie widoczne, inkubować kolejne 24 h (p. 9.2.4).

   🌡 Temperatura: 30 °C

5. Wybór płytek

   Wybrać płytki, najlepiej z dwóch kolejnych rozcieńczeń, z mniej niż 150 koloniami (p. 9.3).

6. Kolonie przypuszczalne

   Kolonie B. cereus na MYP są różowe (mannitol nie jest fermentowany) i otoczone strefą precypitatu (lecytynaza) — według rozdziału 14 podręcznika BAM (FDA); opis kolonii typowych w normie jest w p. 9.3, poza dostępnym tekstem.

7. Test hemolizy

   Kolonie potwierdza się hemolizą na agarze z krwią baranią (p. 5.3, rozdz. 1); według rozdziału 14 podręcznika BAM (FDA) B. cereus zwykle silnie hemolizuje, ze strefą całkowitej (β) hemolizy 2–4 mm, a B. anthracis po 24 h zwykle nie hemolizuje. Liczbę kolonii do potwierdzenia i warunki testu podaje p. 9.4, poza dostępnym tekstem. Według BAM (rozdz. 14) do potwierdzenia bierze się co najmniej 5 kolonii różowych, lecytynazododatnich, a test hemolizy prowadzi się na agarze tryptonowo-sojowym z krwią baranią (24 h, 35 °C).

8. Wynik

   Liczbę przypuszczalnych B. cereus w 1 g albo 1 ml oblicza się z liczby kolonii potwierdzonych (p. 4.3, rozdz. 10).

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Norma nie zawiera rozdziału o bezpieczeństwie — praktykę laboratoryjną odsyła do ISO 7218 (rozdz. 5)
• Potwierdzenie nie odróżnia B. anthracis; przy podejrzeniu jego obecności norma wskazuje dodatkowy test ruchliwości (rozdz. 1, uwaga; zmiana A1, zał. E)

Najczęstsze pytania