🥜 Alergeny pokarmowe: gluten (gliadyna) — ELISA R5

Chemia żywności AOAC 2012.01

Przegląd

STATUS (stan na 06.11.2026). AOAC Official Method 2012.01 — oznaczanie gliadyny jako miary glutenu kanapkową ELISA R5 (zestaw z przeciwciałem R5 i ekstrakcją „koktajlem”, metoda R5 Méndeza). Metodę przyjęto jako First Action w 2012 r. z zakresem „w żywności”; przy statusie Final Action (2016) zakres zawężono do matryc na bazie ryżu i kukurydzy, a po badaniu międzylaboratoryjnym z 14 laboratoriami (J. AOAC Int. 2022, t. 105, z. 2) zmieniono tytuł i zakres stosowania, rozszerzając go m.in. na soję, skrobie, pseudozboża, rośliny strączkowe, przyprawy, soki, mięso, ryby, pieczywo, ciastka i ziemniaki. Ta sama metoda R5 jest metodą typu I Kodeksu Żywnościowego (CXS 118-1979). AOAC 2012.01 dotyczy wyłącznie glutenu (prolamin pszenicy, żyta i jęczmienia) — innych alergenów nie obejmuje. Inne oznaczenia AOAC wymieniane dotąd obok niej to odrębne metody: AOAC 991.19 to ELISA Skerritta, a numer 2014.03 nosi zestaw z przeciwciałem G12.

ZASADA. Dołki mikropłytki są opłaszczone przeciwciałem R5 przeciw gliadynom. Gliadyna z roztworu wzorcowego albo z próbki wiąże się z przeciwciałem; po płukaniu dodaje się przeciwciało R5 sprzężone z peroksydazą, które wiąże się z kompleksem (układ „kanapkowy”). Po kolejnym płukaniu dodaje się substrat i chromogen — związany koniugat przekształca bezbarwny chromogen w niebieski produkt, a roztwór zatrzymujący zmienia barwę na żółtą. Absorbancję mierzy się przy 450 nm; jest proporcjonalna do stężenia gliadyny (ng/ml).

PRZYGOTOWANIE PRÓBKI. Próbkę homogenizuje się w ilości zapewniającej reprezentatywną porcję (np. 50 g). Odważkę 0,25 g (ciecze 0,25 ml) zalewa się 2,5 ml „koktajlu” i ekstrahuje 40 min w łaźni wodnej w 50 °C, po ostygnięciu dodaje 7,5 ml etanolu 80 % i wytrząsa 1 h w temperaturze pokojowej, następnie sączy albo wiruje 10 min przy co najmniej 2500 × g. Żywność z garbnikami i polifenolami (np. czekolada, kawa, kakao, soki owocowe, przyprawy, gryka) ekstrahuje się z dodatkiem 0,25 g odtłuszczonego mleka w proszku; owies — z odważki 1 g i czterokrotnie większej ilości odczynników. Ekstrakt rozcieńcza się buforem 1:12,5, co daje łączny współczynnik rozcieńczenia 500.

OBLICZENIE. Stężenie gliadyny odczytane z krzywej wzorcowej (wzorce 0, 5, 10, 20, 40 i 80 ng/ml) mnoży się przez współczynnik rozcieńczenia 500, a wynik w gliadynie — przez 2, bo według Kodeksu Żywnościowego prolaminy stanowią 50 % glutenu. Przykład z instrukcji: 10 ng/ml → 5 mg/kg gliadyny → 10 mg/kg glutenu. Wyniki między granicą wykrywalności a granicą oznaczalności podaje się jakościowo („< LoQ”).

PRZEPISY. Rozporządzenie (UE) nr 1169/2011, zał. II — 14 grup substancji powodujących alergie lub reakcje nietolerancji, w tym zboża zawierające gluten (pszenica, żyto, jęczmień, owies, orkisz, kamut). Rozporządzenie wykonawcze (UE) nr 828/2014 — „bezglutenowy”: nie więcej niż 20 mg/kg glutenu w żywności sprzedawanej konsumentowi; „o bardzo niskiej zawartości glutenu”: nie więcej niż 100 mg/kg (składniki ze zbóż specjalnie przetworzone w celu zmniejszenia zawartości glutenu); owies w takiej żywności — nie więcej niż 20 mg/kg glutenu. Kodeks Żywnościowy CXS 118-1979: te same progi 20 i 100 mg/kg, oznaczanie metodą immunologiczną o granicy wykrywalności 10 mg glutenu/kg lub niższej, metoda — ELISA R5 Méndeza.

CZEGO TU NIE PODAJEMY. Metoda nie nadaje się do ilościowego oznaczania glutenu sfermentowanego ani zhydrolizowanego. Oznaczania innych alergenów (mleko, jaja, orzeszki ziemne, soja, orzechy, sezam i in.) nie obejmuje — wykonuje się je innymi zestawami, według instrukcji ich producentów; ogólne zasady metod immunologicznych podaje norma EN 15633-1. Precyzji z badania międzylaboratoryjnego podajemy tylko zakres odzysków i odtwarzalności z publikacji (odzysk 80–130 %, względne odchylenie standardowe odtwarzalności 9,8–27,7 %).

Zasada metody

Kanapkowa ELISA z monoklonalnym przeciwciałem R5: gliadyna z ekstraktu wiąże się z przeciwciałem na ściankach dołka, a następnie z przeciwciałem R5 sprzężonym z peroksydazą. Związany koniugat przekształca chromogen w barwny produkt; po zatrzymaniu reakcji absorbancję mierzy się przy 450 nm. Stężenie gliadyny odczytuje się z krzywej wzorcowej, mnoży przez współczynnik rozcieńczenia, a gluten oblicza jako gliadyna × 2.

Zastosowania

• Weryfikacja oznakowania „bezglutenowy” (≤ 20 mg/kg glutenu) i „o bardzo niskiej zawartości glutenu” (≤ 100 mg/kg) — rozporządzenie wykonawcze (UE) nr 828/2014
• Żywność dla osób nietolerujących glutenu — metoda typu I Kodeksu Żywnościowego (CXS 118-1979)
• Wykrywanie gliadyny i pokrewnych prolamin żyta i jęczmienia w żywności o deklarowanym braku glutenu: produkty z ryżu i kukurydzy, soja, skrobie, pseudozboża, rośliny strączkowe, przyprawy, soki, mięso, ryby, pieczywo, ciastka, słodycze, ziemniaki (zakres AOAC 2012.01 po rozszerzeniu z 2022 r.)
• Informacja o alergenach — zboża zawierające gluten jako jedna z 14 grup z zał. II rozporządzenia (UE) nr 1169/2011

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

AOAC Official Method 2012.01

Tytuł (PL)

Gliadyna jako miara glutenu w żywności — kanapkowa ELISA z przeciwciałem R5 (tłumaczenie robocze)

Title (EN)

Gliadin as a measure of gluten in food — R5 sandwich ELISA

Procedura krok po kroku

1. Zapobieganie zanieczyszczeniu

   Praca w rękawiczkach; powierzchnie i sprzęt myte 40 % etanolem albo 2-propanolem; przygotowanie próbek w pomieszczeniu oddzielonym od wykonywania ELISA.

2. Homogenizacja

   Rozdrobnienie i wymieszanie ilości zapewniającej reprezentatywną porcję (np. 50 g); owies — co najmniej 200 g.

3. Ekstrakcja „koktajlem”

   0,25 g (ciecze 0,25 ml) + 2,5 ml „koktajlu”, wymieszanie, 40 min w łaźni wodnej w 50 °C; przy garbnikach i polifenolach dodatek 0,25 g odtłuszczonego mleka w proszku; owies — 1 g i 10 ml.

   ⏱ Czas: 40 min • 🌡 Temperatura: 50 °C

4. Etanol i wytrząsanie

   Krótkie ostudzenie (1–3 min), 7,5 ml etanolu 80 % (owies 30 ml), wytrząsanie 1 h w temperaturze pokojowej.

   ⏱ Czas: 1 h • 🌡 Temperatura: 20–25 °C

5. Klarowanie

   Sączenie albo wirowanie 10 min przy co najmniej 2500 × g; supernatant do czystego naczynia. Nierozcieńczony ekstrakt można przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej do 8 tygodni.

6. Rozcieńczenie

   Ekstrakt 1:12,5 buforem (np. 80 µl + 920 µl) — łączny współczynnik rozcieńczenia 500; zużyć w ciągu 30 min.

7. Inkubacja z próbką

   Po 100 µl wzorców i próbek w dwóch powtórzeniach, 30 min w temperaturze pokojowej; płukanie trzykrotnie po 250 µl buforu płuczącego.

   ⏱ Czas: 30 min

8. Inkubacja z koniugatem

   100 µl rozcieńczonego koniugatu, 30 min w temperaturze pokojowej; płukanie jak wyżej.

   ⏱ Czas: 30 min

9. Reakcja barwna

   50 µl substratu i 50 µl chromogenu, 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności; potem 100 µl roztworu zatrzymującego.

   ⏱ Czas: 30 min

10. Pomiar i obliczenie

    Absorbancja przy 450 nm w ciągu 30 min; stężenie z krzywej wzorcowej × 500 = mg/kg gliadyny; × 2 = mg/kg glutenu. Wyniki powyżej wzorca 6 — ponowne rozcieńczenie ekstraktu.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Badanie wykonuje wyłącznie przeszkolony personel laboratoryjny, ściśle według instrukcji
• „Koktajl” ekstrakcyjny jest szkodliwy dla zdrowia — zawiera merkaptoetanol; pracować pod wyciągiem i unikać kontaktu ze skórą (rękawice)
• Zestaw może zawierać substancje niebezpieczne — zagrożenia według kart charakterystyki producenta
• Odczynniki i materiały po użyciu — odzysk albo unieszkodliwienie według przepisów krajowych o odpadach

Najczęstsze pytania